באמצעות מודלי דג זברה של נגיף שפעת A האדם למסך תרופות אנטי ולאפיין מארח תגובות תא חיסון

Summary

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Abstract

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Introduction

על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), נגיפי שפעת להדביק 5-10% של מבוגרים 20-30% מהילדים בשנה ולגרום 3-5 מיליון מקרים של מחלה חמורה עד 500,000 מקרי מוות ברחבי העולם ^1. חיסונים נגד שפעת שנתיים להישאר האפשרות הטובה ביותר כדי למנוע מחלות. מאמצים מהסוג תוכנית הפעולה העולמי WHO גדלו השימוש בחיסון העונתי, קיבולת ייצור החיסון, ומחקר ופיתוח לתוך אסטרטגיות חיסון חזקה יותר על מנת להפחית את התחלואה והתמותה הקשורים התפרצויות שפעת עונתית ^2. תרופות אנטי-ויראליות כמו מעכבי נורמינידאז (למשל Zanamivir ו Oseltamivir) זמינות במדינות מסוימות ו הוכיחו יעיל בתסמינים מקילות, כאשר מנוהלות בתוך 48 שעות מהופעה ^{3 הראשונות, 4, 5.} למרות מאמצים הגלובליים, הכלה של שפעת עונתית outbreaks עדיין מהווה אתגר עצום בשלב זה, כפי להיסחף אנטיגני וירוס שפעת לעיתים קרובות עולה היכולות הנוכחיות להסתגל הגנום המשתנה של הנגיף ^6. אסטרטגיות חיסון מיקוד זנים של וירוס חדש יש לפתח מראש ולפעמים ניתנים פחות יעיל בצורה אופטימלית בשל שינויים בלתי צפויים סוגי זנים שבסופו של דבר שולטים מגיפת שפעת. מסיבות אלו, יש צורך ברור לפתח אסטרטגיות טיפוליות חלופיות המכיל זיהומים וצמצום תמותה. על ידי השגת הבנה טובה יותר של האינטראקציה המאכסנת-הווירוס, זה עשוי להיות אפשרי לפתח תרופות נגד שפעת חדשות וטיפולים אדג'ובנט ^{7, 8.}

מארח השפעת האנושית וירוס (IAV) אינטראקציה מורכבת. במודלים של בעלי חיים כמה הידבקות בני אדם IAV פותחו על מנת לקבל תובנות לגבי האינטראקציה מאכסן-וירוס, including עכברים, שרקנים, חולדות כותנה, אוגרים, חמוסים, ואת קופי ^9. תוך מתן מידע חשוב שיפרו את הבנת הדינמיקה מאכסן IAV, כל אורגניזם מודל בעל חסרונות משמעותיים כי יש לקחת בחשבון כאשר מנסים לתרגם את הממצאים רפואת האדם. לדוגמה, עכברים, שהן המודל הנפוץ ביותר, לא בקלות לפתח סימפטומים IAV הנגרמת זיהום כאשר נגוע בשפעת אדם מבודד ^9. הסיבה לכך היא כי עכברים חסרי הכמיהות הטבעיות לשפעת אדם מבודדות מאז תאי אפיתל העכבר להביע α-2,3 קשרי חומצת sialic במקום α-2,6 קשרי חומצת sialic הביעו על תאים אנושיים אפיתל ^10. חלבוני hemagglutinin נוכח אדם IAV מבודדים לאגד לטובה וזן תאי מארחי נושאות α-2,6 קשרי חומצת sialic באמצעות אנדוציטוזה מתווך קולטן ^{9, 11,} </sעד> ^{12, 13.} כתוצאה מכך, הוא היום מקובל בפיתוח מודלי עכבר לשפעת אדם, יש להקפיד על מנת לשייך את המתח המתאים של עכבר עם הזן המתאים של שפעת על מנת להשיג פנוטיפים מחלה כי לשחזר היבטים של המחלה האנושית. לעומת זאת, תאי אפיתל דרכי הנשימה העליונות של חמוסים להחזיק α-2,6 קשרי חומצת sialic דומות ¹⁴ תאים אנושיים. חמוסים אינפקטד לשתף רבות מהתכונות פתולוגיים וקליניים שנצפתה מחלות אנושיות, כולל פתוגניות ויכולת ההעברה של נגיפי שפעת אנושית העופות ^{14, 15.} הם גם מאוד מקובלים ניסוייים יעילות חיסון. עם זאת, המודל החמוס לשפעת אדם יש מספר חסרונות הקשורים בעיקר גודלן ועלות הגידול בעלי שהופכים רכישת סטטיסטית מובהקתנתוני צביעות מאתגרים. בנוסף, חמוסים הפגינו בעבר בדלים הפרמקוקינטיקה סמים, זמינות ביולוגית, ורעילות שהופכים יעילות בדיקות קשות. לדוגמה, חמוסים להפגין רעילות amantadine מעכב ערוץ יון M2 ^16. לפיכך, ברור כי בבחירה במודל חיה בחקר שאלות על זיהומי אדם IAV, חשוב לשקול יתרונות הטבועים בו ומגבלות, וההיבט של האינטראקציה מאכסן-הווירוס כי הוא תחת חקירה.

דג הזברה, Danio rerio, הוא במודל חיה המספק הזדמנויות ייחודיות לחקר זיהום מיקרוביאלי, לארח תגובה חיסונית, וטיפולים תרופתיים פוטנציאל ^{17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,} <sup class = "Xref"> ^{24, 25, 26, 27, 28.} הנוכחות של α-2,6 צמודות חומצות sialic על פני השטח של תאי דג הזברה הציעה הרגישות שלו IAV, אשר היה מובל החוצה במחקרי זיהום צלם in vivo באמצעות זן כתב ניאון של IAV ^19. בשנת דג הזברה IAV נגועים, ביטוי מוגבר של תמלילי ifnphi1 ו MXA אנטי הצביעו על כך תגובה חיסונית מולדת היה מגורה, ואת הפתולוגיה שהפגינו דג הזברה IAV נגועים, כולל בצקת והרס רקמות, היה דומה לזה שנצפה זיהומים שפעת אנושית . יתר על כן, התמותה המוגבלת אנטי נורמינידאז IAV מעכב Zanamivir ו שכפול נגיפי מופחת של דג זברה ^19.

בדו"ח זה, פרוטוקול לייזום מערכתic IAV זיהומים עוברי דג הזברה מתואר. שימוש Zanamivir במינונים רלוונטיים קליני בתור הוכחה של עיקרון, השירות של מודל דג זברת IAV זיהום בתרכובת הקרנה לפעילות אנטי מודגם. בנוסף, פרוטוקול להפקה מקומית, דלקת IAV אפיתל של דג הזברה לשחות שלפוחית שתן, איבר נחשב מבחינה אנטומית והן מבחינה תפקודית מקביל הריאה היונקת ^{21, 29, 30, 31,} מתואר. שימוש זה מודל זיהום מקומי IAV, גיוס נויטרופילים לאתר של זיהום יכול להיות במעקב, המאפשר חקירות לתוך התפקיד של ביולוגיה נויטרופילים זיהום ודלקת IAV. מודלי דג זברה אלה משלימים במודלים של בעלי חיים קיימים של זיהומי אדם IAV והם שימושיים במיוחד לבדיקת מולקולות קטנות ותגובות תא חיסון בשל האפשרות של ים משופרכוח tatistical, יכולת בינונית מבחני תפוקה גבוהה, ואת היכולות לעקוב אחר התנהגות התא החיסונית ותפקוד עם מיקרוסקופ אור.

Protocol

כל העבודה צריכה להתבצע באמצעות biosafety ברמה 2 (או BSL2) סטנדרטים המתוארים על-ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות (CDC) ובהתאם להוראות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדות שימוש (IACUC). אנא להתייעץ עם הגורמים המתאימים על מנת להבטיח בטיחות ותאימות. <p class="jove_title" style=";text-align:right…

Representative Results

הנה, נתונים המראים כיצד מערכתי זיהום IAV דג הזברה יכול לשמש כדי לבדוק את יעילות תרופה (איור 1 א) הנם מסופקים. עובר ב 48 שעות לאחר הפריה מוזרקת עם APR8 (1C הדמוי, 1F), X-31 (1D הדמוי, 1G), או שהם ns1-GFP (איורי 1H-ט 1) דרך הצינור של קיביה ל…

Discussion

כדי למקסם את היתרונות זכו משימוש חיה קטנה מודל אינטראקציות מארח הפתוגן אנושיים, חשוב לנסח שאלות מחקר ושערות בדיקה כי לנצל את היתרונות טמונים במערכת המודל. כמודל הידבקות בני אדם IAV, דג הזברה יש מספר חוזקות, כוללים פוריות גבוהה, בהירות אופטית, amenability כדי הקרנת סמים, וזמי?…

Materials

Instant Ocean	Spectrum Brands	SS15-10
100 x 25 mm sterile disposable Petri dishes	VWR	89107-632
Transfer pipettes	Fisherbrand	13-711-7M
Tricaine- S (MS-222)	Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament	Sutter Instrument	BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Agarose	Lonza	50004
Zanamivir	AK Scientific	G939
Dumont #5 forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Microscope immersion oil	Olympus	IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide	AmScope	MR095
MPPI-3 pressure injector	Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope	Olympus	SZ61
Back pressure unit	Applied Scientific Instrumentation	BPU
Micropipette holder kit	Applied Scientific Instrumentation	MPIP
Foot switch	Applied Scientific Instrumentation	FSW
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MM33
Magnetic base	Applied Scientific Instrumentation	Magnetic Base
Phenol red	Sigma-Aldrich	P-4758
Low temperature incubator	VWR	2020
SteREO Discovery.V12	Zeiss
Illuminator	Zeiss	HXP 200C
Cold light source	Zeiss	CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well	Mattek	P24G-0-13-F
Confocal microscope	Olympus	IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software	Olympus
Prism v6	GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus	Charles River	490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)	Charles River	490715
Influenza NS1-GFP			Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry)			Referenced in Lam et al. 2013