باستخدام نماذج الزرد من الإنسان الأنفلونزا فيروس العدوى الى الشاشة المضادة للفيروسات المخدرات وتوصيف المضيف المناعي الردود خلية

Summary

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Abstract

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Introduction

ووفقا لمنظمة الصحة العالمية (WHO)، بفيروسات الأنفلونزا تصيب 10/05٪ من البالغين و20-30٪ من أطفال سنويا وتسبب 3-5٬000٬000 الحالات المرضية الوخيمة وما يصل إلى 500،000 الوفيات في جميع أنحاء العالم ^1. لا تزال لقاحات السنوية ضد الانفلونزا الخيار الأفضل للوقاية من المرض. وقد زادت جهود مثل خطة العمل العالمية لمنظمة الصحة العالمية استخدام اللقاح الموسمي، والقدرة على إنتاج اللقاحات، والبحث والتطوير في استراتيجيات لقاح أكثر فعالية من أجل خفض معدلات المراضة والوفيات المرتبطة فاشيات الأنفلونزا الموسمية ^2. هي الأدوية المضادة للفيروسات مثل مثبطات النورامينيداز (على سبيل المثال زاناميفير وأوسيلتاميفير) المتوفرة في بعض البلدان وأثبتت فعاليتها في تخفيف أعراض، عندما تدار داخل ساعة 48 الأولى من بداية ^{3، 4، 5.} وعلى الرغم من الجهود العالمية، احتواء الانفلونزا الموسمية أوويبقى tbreaks تحديا هائلا في هذا الوقت، وفيروس الأنفلونزا الانجراف الأنتيجين غالبا ما يتجاوز قدرات الحالية للتكيف مع الجينوم المتغيرة للفيروس ^6. ويجب وضع استراتيجيات لقاح يستهدف سلالات جديدة من الفيروس في وقت مبكر ويتم تقديمها في بعض الأحيان أقل من فعالة على النحو الأمثل بسبب التغيرات غير المتوقعة في أنواع السلالات التي تسود في نهاية المطاف في موسم الأنفلونزا. لهذه الأسباب، هناك حاجة واضحة لتطوير استراتيجيات علاجية بديلة لاحتواء العدوى والحد من الوفيات. طريق التوصل إلى فهم أفضل للتفاعل المضيفة للفيروسات، قد يكون من الممكن لتطوير الأدوية المضادة للانفلونزا الجديدة والعلاجات المساعدة ^{7 و 8.}

والإنسان المضيف الأنفلونزا A التفاعل فيروس (IAV) معقد. وقد وضعت عدة نماذج حيوانية من العدوى IAV البشري من أجل الحصول على نظرة ثاقبة على التفاعل المضيفة للفيروسات، امبجي الفئران والخنازير الغينية والفئران القطن، الهامستر والقوارض، وقرود المكاك ^9. في الوقت الذي توفر البيانات الهامة التي عززت فهم الديناميات في استضافة IAV، كل كائن نموذج يمتلك السلبيات الهامة التي يجب مراعاتها عند محاولة تحويل النتائج إلى الطب البشري. على سبيل المثال، والفئران، والتي هي النموذج الأكثر استخداما على نطاق واسع، لا تتطور بسهولة أعراض العدوى التي يسببها IAV-عند المصابين بالانفلونزا البشرية يعزل ^9. وذلك لأن الفئران تفتقر إلى مع الأجسام الطبيعية للأنفلونزا البشرية يعزل منذ خلايا فأر الظهارية تعبر عن 2،3 ألفا الروابط حمض اللعابي بدلا من الروابط حمض اللعابي α-2،6 أعرب عن الخلايا الظهارية الإنسان ^10. البروتينات راصة دموية موجودة في IAV البشري العزلات ربط بشكل إيجابي ودخول الخلايا المضيفة التي تحمل روابط الحامض اللعابي ألفا 2،6 من خلال مستقبلات بوساطة الإلتقام ^{9، 11،} </sتصل> ^{12 و 13.} ونتيجة لذلك، ومن المسلم به الآن أن في تطوير نماذج الماوس لالإنفلونزا البشرية، يجب توخي الحذر لإقران سلالة المناسب من الماوس مع الضغط المناسب للأنفلونزا من أجل تحقيق الظواهر المرض الذي ألخص جوانب الأمراض التي تصيب الإنسان. في المقابل، الخلايا الظهارية في الجهاز التنفسي العلوي للقوارض تمتلك 2،6 ألفا الروابط حمض اللعابي التي تشبه خلايا الإنسان ^14. تشترك القوارض المصابة العديد من الميزات المرضية والسريرية التي لوحظت في الأمراض التي تصيب البشر، بما في ذلك المرضية وعلى الانتقال من فيروسات الانفلونزا البشرية والطيور ^{14 و 15.} بل هي أيضا قابلة للغاية لمحاكمات نجاعة اللقاح. ومع ذلك، فإن نموذج النمس للأنفلونزا البشري لديه عدة عيوب تتعلق أساسا حجمها وتكلفة تربية التي تجعل الحصول على signifi إحصائياالبيانات غير قادر على التحدي. وبالإضافة إلى ذلك، وفرت عرض سابقا الاختلافات في حركية الدواء، التوافر البيولوجي، وسمية التي تجعل اختبار فعالية صعوبة. على سبيل المثال، قوارض يحمل سمية إلى M2 القناة الايونية المانع الأمانتادين ^16. وبالتالي، فمن الواضح أن في اختيار نموذج حيواني لدراسة الأسئلة حول التهابات IAV الإنسان، فمن المهم النظر في المزايا الكامنة والقيود، وجانب من جوانب التفاعل المضيفة للفيروسات التي هي قيد التحقيق.

الزرد، دانيو rerio، هو نموذج الحيوان الذي يوفر فرصا فريدة للتحقيق العدوى الميكروبية، استضافة الاستجابة المناعية، والعلاجات المحتملة المخدرات ^{17، 18، 19، 20، 21، 22، 23،} <الطبقة سوب = "XREF"> ^{24، 25، 26، 27، 28.} وجود الأحماض اللعابي المرتبطة α-2،6 على سطح الخلايا في الزرد اقترح قابليته للIAV الذي تنعم به في دراسات العدوى وتصوير في الجسم الحي باستخدام سلالة مراسل فلوري من IAV ^19. في الزرد المصابين IAV، أشارت زيادة التعبير عن فيروسات ifnphi1 وMXA النصوص أن الاستجابة المناعية الفطرية قد تعززت، وكان علم الأمراض المعروضة من قبل الزرد المصابين IAV، بما في ذلك وذمة وتدمير الأنسجة، على غرار تلك التي لوحظت في عدوى الإنفلونزا البشرية . وعلاوة على ذلك، فإن IAV المضادة للفيروسات النورامينيداز المانع زاناميفير فيات محدودة وانخفاض تكاثر الفيروس في الزرد ^19.

في هذا التقرير، وبروتوكول لجهاز التفجيروصفت إصابات جيم IAV في الأجنة الزرد. باستخدام زاناميفير بجرعات ذات الصلة سريريا بمثابة إثبات صحة المبدأ، أثبتت فائدة هذا النموذج العدوى IAV الزرد لمركبات الكشف عن النشاط المضاد للفيروسات. وبالإضافة إلى ذلك، وبروتوكول لتوليد المحلية، والعدوى IAV الظهارية في الزرد السباحة المثانة، الجهاز الذي يعتبر تشريحيا ووظيفيا مماثلة لالرئة الثدييات ^{21، 29، 30، 31،} يوصف. باستخدام هذا النموذج العدوى IAV المحلية، يمكن تتبع تجنيد العدلات إلى موقع الإصابة، مما التحقيقات في دور البيولوجيا العدلات في العدوى IAV والالتهابات. هذه النماذج الزرد تكمل النماذج الحيوانية الموجودة الالتهابات IAV الإنسان ومفيدة بشكل خاص لاختبار الجزيئات الصغيرة واستجابات الخلايا المناعية بسبب إمكانية تعزيز الصورةالسلطة tatistical، والقدرة على moderate- لفحوصات عالية الإنتاجية، والقدرة على تتبع سلوك الخلايا المناعية وظيفة مع ضوء المجهر.

Protocol

يجب أن يتم تنفيذ جميع الأعمال باستخدام مستوى السلامة الحيوية 2 (أو BSL2) المعايير التي وصفها المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض (CDC) وفقا للتوجيهات التي وضعتها المؤسسات ورعاية الحيوان واللجان الاستخدام (IACUC). يرجى تشاور مع المسؤولين المعنيين لضمان السلامة والامتثال. <p …

Representative Results

هنا، يتم توفير البيانات التي تبين كيفية العدوى IAV النظامية في الزرد يمكن استخدامها لاختبار نجاعة الأدوية (الشكل 1A). يتم حقن أجنة في 48 ساعة بعد الإخصاب مع APR8 (أرقام 1C، 1F)، X-31 (أرقام 1D، 1G)، أو NS1-GFP (أرقام 1H-1I) عبر القناة …

Discussion

لتحقيق أقصى قدر من الفوائد المكتسبة من استخدام الحيوانات الصغيرة لنموذج التفاعلات المضيف الممرض الإنسان، فمن المهم لتأطير أسئلة البحث واختبار الفرضيات أن الاستفادة من المزايا الكامنة في النظام النموذجي. كنموذج للعدوى IAV الإنسان، والزرد لديها العديد من نقاط القوة،…

Materials

Instant Ocean	Spectrum Brands	SS15-10
100 x 25 mm sterile disposable Petri dishes	VWR	89107-632
Transfer pipettes	Fisherbrand	13-711-7M
Tricaine- S (MS-222)	Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament	Sutter Instrument	BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Agarose	Lonza	50004
Zanamivir	AK Scientific	G939
Dumont #5 forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Microscope immersion oil	Olympus	IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide	AmScope	MR095
MPPI-3 pressure injector	Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope	Olympus	SZ61
Back pressure unit	Applied Scientific Instrumentation	BPU
Micropipette holder kit	Applied Scientific Instrumentation	MPIP
Foot switch	Applied Scientific Instrumentation	FSW
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MM33
Magnetic base	Applied Scientific Instrumentation	Magnetic Base
Phenol red	Sigma-Aldrich	P-4758
Low temperature incubator	VWR	2020
SteREO Discovery.V12	Zeiss
Illuminator	Zeiss	HXP 200C
Cold light source	Zeiss	CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well	Mattek	P24G-0-13-F
Confocal microscope	Olympus	IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software	Olympus
Prism v6	GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus	Charles River	490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)	Charles River	490715
Influenza NS1-GFP			Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry)			Referenced in Lam et al. 2013