Brug zebrafisk modeller af human influenza A-virus infektioner at Screen antivirale lægemidler og karakterisere værtsimmunsystem Cell Responses

Summary

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Abstract

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Introduction

Ifølge World Health Organization (WHO), influenzavirus inficere 5-10% af voksne og 20-30% af børn årligt og forårsage 3-5 millioner tilfælde af alvorlig sygdom og op til 500.000 dødsfald på verdensplan ^en. Årlige vaccinationer mod influenza forblive den bedste mulighed for at forebygge sygdom. Indsatsen som WHO globale handlingsplan har øget sæsonbetinget vaccine brug, vaccine produktionskapacitet, og forskning og udvikling i mere potente vaccine strategier for at reducere sygelighed og dødelighed i forbindelse med årstidens influenzaudbrud ^2. Antivirale lægemidler som neuraminidasehæmmere (f.eks Zanamivir og Oseltamivir) er tilgængelige i nogle lande og har vist sig effektive i formildende symptomer, når det gives inden for de første 48 timer af debut ^{3, 4, 5.} Trods den globale indsats, inddæmning af sæsoninfluenza outbreaks bliver en vældig udfordring på dette tidspunkt, som influenzavirus antigen drift ofte overstiger nuværende evner at tilpasse sig den skiftende virussets genom ^6. Vaccine strategier rettet mod nye virusstammer skal udvikles på forhånd og er undertiden gøres mindre end optimalt effektive på grund af uforudsete ændringer i de typer af stammer, der i sidste ende dominerer i en influenza sæson. Af disse grunde er der et klart behov for at udvikle alternative terapeutiske strategier for indeholdende infektioner og reducere dødelighed. Ved at opnå en bedre forståelse af vært-virus interaktion, kan det være muligt at udvikle nye anti-influenza-medicin og adjuvans terapier ^{7, 8.}

Den menneskelige vært-influenza A-virus (IAV) interaktion er kompleks. Adskillige dyremodeller for humane IAV infektion er blevet udviklet med henblik på at få indsigt i vært-virus interaktion, herunding mus, marsvin, bomuldsrotter, hamstere, fritter, og makakaber ^9. Samtidig med vigtige data, har øget forståelsen af ​​værten-IAV dynamik, hver model organisme besidder betydelige ulemper, der skal overvejes, når du forsøger at oversætte resultaterne i human medicin. For eksempel mus, som er den mest udbredte model, ikke let udvikle IAV-induceret infektion symptomer, når inficeret med human influenzaisolater ^9. Dette er fordi mus mangler den naturlige tropisme for human influenza isolater siden muse epitelceller udtrykker a-2,3 sialinsyrebindinger stedet for α-2,6 sialinsyrebindinger udtrykt på humane epitelceller ^10. Hæmagglutininet proteiner til stede i human IAV isolater positivt binde og indtast værtsceller bærende a-2,6 sialinsyrebindinger gennem receptor-medieret endocytose ^{9, 11,} </sop> ^{12, 13.} Som følge heraf er det nu accepteret, at ved udviklingen musemodeller for human influenza, skal der drages omsorg for at parre den passende stamme af mus med den passende stamme af influenza for at opnå sygdomsfænotyper der rekapitule- aspekter af den menneskelige sygdom. I modsætning hertil epitelceller i de øvre luftveje af fritter besidder a-2,6 sialinsyrebindinger der ligner humane celler ^14. Inficerede fritter deler mange af de patologiske og kliniske træk observeret i humane sygdom, herunder sygdomsfremkaldende og overførbarhed af menneskelige og aviær influenza-virus ^{14, 15.} De er også meget modtagelige for vaccine effektivitetsundersøgelserne. Ikke desto mindre er ilder model for human influenza har flere ulemper primært relateret til deres størrelse og omkostningerne ved dyrehold, der gør erhvervelse af statistisk signifisentlige data udfordrende. Derudover har fritter tidligere viste forskelle i farmakokinetik, biotilgængelighed og toksicitet, der gør testning af effektiviteten vanskelig. For eksempel, fritter udviser toksicitet over for M2 ionkanalen inhibitor amantadin ^16. Det er således klart, at i at vælge en dyremodel til at undersøge spørgsmål om humane IAV infektioner, er det vigtigt at overveje sine iboende fordele og begrænsninger, samt det aspekt af vært-virus interaktion, der er under undersøgelse.

Den zebrafisk, Danio rerio, er en dyremodel, der giver unikke muligheder for at undersøge mikrobiel infektion, vært immunreaktion, og potentielle lægemiddelterapier ^{17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,} <sup class = "xref"> ^{24, 25, 26, 27, 28.} Tilstedeværelsen af α-2,6-bundne sialinsyrer på overfladen af celler i zebrafisk foreslog sin modtagelighed for IAV, der blev bekræftet i infektionsstudier og afbildes in vivo ved anvendelse af en fluorescerende reporter stamme af IAV ^19. I IAV-inficerede zebrafisk, forøget ekspression af de antivirale ifnphi1 og mxa udskrifter indikerede, at en medfødt immunrespons var blevet stimuleret, og patologi vises af IAV-inficerede zebrafisk, herunder ødem og ødelagt væv, var den samme som observeret i influenzainfektioner menneskelige . Endvidere IAV antivirale neuraminidasehæmmer Zanamivir begrænset mortalitet og reduceret viral replikation i zebrafisk ^19.

I denne rapport, en protokol for at indlede systemetic IAV infektioner i zebrafisk embryoner er beskrevet. Brug Zanamivir ved klinisk relevante doser som en proof-of-princippet er nytten af ​​denne zebrafisk IAV infektion model for screening forbindelser til antiviral aktivitet demonstreret. Desuden er en protokol til at frembringe et lokaliseret, epitelial IAV infektion i zebrafisk svømme blære, et organ, der anses for at være anatomisk og funktionelt er analog med den mammale lunge ^{21, 29, 30, 31,} beskrives. Brug af denne lokaliseret IAV infektion model, kan neutrofil rekruttering til infektionsstedet spores, således undersøgelser af den rolle af neutrofil biologi i IAV infektion og inflammation. Disse zebrafisk modeller supplere eksisterende dyremodeller for humane IAV infektioner og er særligt nyttige til afprøvning af små molekyler og immune celleresponser på grund af muligheden for øget sTATISTISK effekt, evne til med moderate high-throughput assays, og evnen til at spore immuncelle adfærd og funktion med lys-mikroskopi.

Protocol

Alt arbejde skal udføres ved hjælp af biosikkerhed niveau 2 (eller BSL2) standarder beskrevet af det amerikanske Centers for Disease Control (CDC) og i overensstemmelse med direktiver fastsat af Institutional Animal Care og Brug udvalg (IACUC). Venligst konferere med de relevante embedsmænd for at sikre sikkerhed og overholdelse. 1. zebrafisk Vedligeholdelse Gyde zebrafisk og indsamle det nødvendige antal embryoer til forsøgene. Om nødvendigt masse avl tanke, som dem beskrev…

Representative Results

Her bliver data, der viser, hvordan systemisk IAV infektion i zebrafisk kan anvendes til at teste lægemiddelvirkningsfuldhed (figur 1A) billede. Embryoner efter 48 timer efter befrugtning injiceres med APR8 (figurerne 1C, 1F), X-31 (figurerne 1D, 1G), eller NS1-GFP (fig 1H-1I) via kanalen af Cuvier at indlede en virusinfektion. En anden kohorte af embryoner på 48 timer efter befrugtningen blev injiceret for at tjene so…

Discussion

For at maksimere fordelene erfaringer fra at bruge et lille dyr til at modellere menneskelige vært-patogen interaktioner, er det vigtigt at indramme forskningsspørgsmål og afprøve hypoteser, der udnytter de iboende fordele ved modelsystemet. Som model for menneskelig IAV infektion, den zebrafisk har flere styrker, herunder høj frugtbarhed, optisk klarhed, modtagelighed for screening narkotika, og tilgængeligheden af ​​transgene linier, som mærker immunceller som neutrofiler. Zebrafisk er blevet udviklet som e…

Materials

Instant Ocean	Spectrum Brands	SS15-10
100 x 25 mm sterile disposable Petri dishes	VWR	89107-632
Transfer pipettes	Fisherbrand	13-711-7M
Tricaine- S (MS-222)	Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament	Sutter Instrument	BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Agarose	Lonza	50004
Zanamivir	AK Scientific	G939
Dumont #5 forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Microscope immersion oil	Olympus	IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide	AmScope	MR095
MPPI-3 pressure injector	Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope	Olympus	SZ61
Back pressure unit	Applied Scientific Instrumentation	BPU
Micropipette holder kit	Applied Scientific Instrumentation	MPIP
Foot switch	Applied Scientific Instrumentation	FSW
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MM33
Magnetic base	Applied Scientific Instrumentation	Magnetic Base
Phenol red	Sigma-Aldrich	P-4758
Low temperature incubator	VWR	2020
SteREO Discovery.V12	Zeiss
Illuminator	Zeiss	HXP 200C
Cold light source	Zeiss	CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well	Mattek	P24G-0-13-F
Confocal microscope	Olympus	IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software	Olympus
Prism v6	GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus	Charles River	490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)	Charles River	490715
Influenza NS1-GFP			Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry)			Referenced in Lam et al. 2013