Usando modelos de Zebrafish de infecções por vírus gripe humana A para Screen antivirais e Caracterizar imune do hospedeiro respostas de células

Summary

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Abstract

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Introduction

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), o vírus da gripe infectar 5-10% dos adultos e 20-30% das crianças anualmente e causar 3-5 milhões de casos de doença grave e até 500.000 mortes no mundo ^1. vacinação anual contra a gripe continuam a ser a melhor opção para prevenir a doença. Esforços como o Plano de Acção Global da OMS têm aumentado o uso da vacina sazonal, a capacidade de produção de vacinas e pesquisa e desenvolvimento de estratégias de vacinas mais potentes, a fim de reduzir a morbilidade e mortalidade associada a surtos de gripe sazonais ^2. Os medicamentos antivirais como inibidores da neuraminidase (por exemplo Zanamivir e oseltamivir) estão disponíveis em alguns países e provaram ser eficazes nos sintomas atenuantes, quando administrado nas primeiras 48 horas de início ^{3, 4, 5.} Apesar dos esforços globais, a contenção da gripe sazonal UOtbreaks continua a ser um desafio formidável neste momento, como o vírus da gripe variação antigénica excede frequentemente capacidades actuais para se adaptar à evolução do genoma do vírus ^6. estratégias de vacina visando novas estirpes do vírus devem ser desenvolvidos com antecedência e são, por vezes, tornar-se menos do que optimamente eficaz devido a mudanças imprevistas nos tipos de estirpes que, eventualmente, predominam em uma época de gripe. Por estas razões, existe uma clara necessidade de desenvolver estratégias terapêuticas alternativas para conter infecções e reduzir a mortalidade. Ao atingir uma melhor compreensão da interação vírus-hospedeiro, pode ser possível desenvolver novos medicamentos anti-gripe e terapias adjuvantes ^{7, 8.}

O host-gripe humana A interação do vírus (IAV) é complexa. Vários modelos animais da infecção pelo IAV humana têm sido desenvolvidos, a fim de obter insights sobre a interação vírus-hospedeiro, incluing ratos, cobaias, ratos de algodão, hamsters, furões e macacos ^9. Enquanto fornece dados importantes que melhoraram a compreensão da dinâmica de acolhimento-IAV, cada organismo modelo possui desvantagens significativas que devem ser considerados quando se tenta traduzir as descobertas em medicina humana. Por exemplo, os ratos, que são o modelo mais amplamente utilizado, não prontamente desenvolver sintomas de infecção induzidas IAV quando infectadas com gripe humana isola ^9. Isto é porque os ratos não têm o tropismo natural para a gripe humana isolados uma vez que as células epiteliais do rato expressam ct-2,3 ligações de ácido siálico, em vez de os α-2,6 ligações de ácido siálico expressos em células epiteliais humanas ^10. As proteínas hemaglutinina presentes em isolados humanos IAV favoravelmente ligar e entrar nas células hospedeiras tendo ligações de ácido siálico alfa-2,6 por meio de endocitose mediada por receptores ^{9, 11,} </s-se> ^{12, 13.} Como consequência, é agora aceite que no desenvolvimento de modelos de rato para a gripe humana, o cuidado deve ser tomado para emparelhar a tensão adequada de rato com a tensão adequada de gripe, de modo a alcançar fenótipos da doença que recapitulam aspectos da doença humana. Em contraste, as células epiteliais no tracto respiratório superior de furões possuem 2,6 a-ligações de ácido siálico que se assemelham a células de origem humana ^14. Furões infectados compartilham muitas das características patológicas e clínicas observadas na doença humana, incluindo a patogenicidade e transmissibilidade dos vírus da gripe humanos e aviários ^{14, 15.} Eles também são altamente passíveis de testes de eficácia da vacina. No entanto, o modelo de ferret para a gripe humana tem várias desvantagens relacionadas principalmente ao seu tamanho e custo de criação que fazem aquisição de estatisticamente signifidados signifi desafiadoras. Além disso, furões têm exibido previamente diferenças na farmacocinética dos medicamentos, biodisponibilidade e toxicidade que fazem eficácia teste difícil. Por exemplo, furões apresentar toxicidade para o M2 canal iônico amantadina inibidor ^16. Assim, é claro que na escolha de um modelo animal para estudar dúvidas sobre infecções IAV humanos, é importante considerar as suas vantagens e limitações inerentes, e o aspecto da interacção hospedeiro-vírus que está sob investigação.

O peixe-zebra, Danio rerio, é um modelo animal que oferece oportunidades únicas para a investigação de infecção microbiana, resposta imune do hospedeiro, e terapias medicamentosas potenciais ^{17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,} <classe sup = "xref"> ^{24, 25, 26, 27, 28.} A presença de ácidos siálicos α-2,6-ligadas na superfície de células do peixe-zebra sugeriu a sua susceptibilidade para IAV, o que foi confirmado em estudos de infecção e fotografada in vivo, utilizando uma estirpe repórter fluorescente de ¹⁹ IAV. Em peixes-zebra IAV-infectadas, a expressão aumentada dos antivirais ifnphi1 e MXA transcritos indicaram que uma resposta imune inata tinha sido estimulado, e a patologia exibida por peixe-zebra IAV-infectados, incluindo edema e destruição de tecidos, foi semelhante ao observado em infecções por influenza humanos . Além disso, o inibidor da neuraminidase IAV antiviral zanamivir mortalidade limitado e reduzido de replicação viral em peixes-zebra ^19.

Neste relatório, um protocolo para o sistema iniciarinfecções IC IAV em embriões de peixe-zebra é descrita. Usando Zanamivir em doses clinicamente relevantes como uma prova de princípio, a utilidade deste modelo de peixe-zebra infecção IAV para rastreio de compostos para a atividade antiviral é demonstrada. Além disso, um protocolo para a geração de uma localizada, infecção epitelial IAV no peixe-zebra nadar bexiga, um órgão que é considerado anatomicamente e funcionalmente análogo ao do pulmão de mamífero ^{21, 29, 30, 31,} é descrito. Usando este modelo de infecção localizada IAV, o recrutamento dos neutrófilos para o local da infecção podem ser rastreados, permitindo que as investigações sobre o papel dos neutrófilos em biologia IAV infecção e inflamação. Estes modelos de peixe-zebra complementar modelos animais existentes de infecções IAV humanos e são particularmente úteis para testar pequenas moléculas e as respostas de células imunitárias, devido à possibilidade de s reforçadapoder Serviço Estatístico, a capacidade de moderado a ensaios de alto rendimento, e as habilidades para rastrear o comportamento de células imunes e função com luz de microscopia.

Protocol

Todo o trabalho deve ser realizado utilizando nível de biossegurança 2 (ou BSL2) normas descritas pelos Centros de Controle de Doenças (CDC) e de acordo com as diretrizes fixadas pela Institutional Animal Care e Comitês Uso (IACUC). Por favor conferir com as autoridades apropriadas para garantir a segurança e conformidade. 1. Cuidados e Manutenção Zebrafish Gerar peixe-zebra e recolher o número necessário de embriões para as experiências. Quando necessário, os tanques …

Representative Results

Aqui, os dados que mostram como a infecção sistémica IAV no peixe-zebra pode ser usado para testar a eficácia do fármaco (Figura 1A) são fornecidos. Embriões em 48 horas pós-fertilização são injectados com APR8 (Figuras 1C, 1F), X-31 (Figuras 1E, 1G), ou NS1-GFP (Figuras 1 H-1I) através da conduta de Cuvier para iniciar uma infecção viral. Outro grupo de embriões em 48 horas pós-fertilização foram injet…

Discussion

Para maximizar os benefícios obtidos com o uso de um pequeno animal para modelar interações patógeno-hospedeiro humano, é importante para enquadrar questões de pesquisa e testar hipóteses que capitalizar sobre as vantagens inerentes do sistema modelo. Como um modelo para a infecção pelo IAV humano, o peixe-zebra tem vários pontos fortes, incluindo alta fecundidade, claridade óptica, receptividade ao rastreio de drogas, e da disponibilidade de linhas transgénicas que rotulam células do sistema imunológico, …

Materials

Instant Ocean	Spectrum Brands	SS15-10
100 x 25 mm sterile disposable Petri dishes	VWR	89107-632
Transfer pipettes	Fisherbrand	13-711-7M
Tricaine- S (MS-222)	Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament	Sutter Instrument	BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Agarose	Lonza	50004
Zanamivir	AK Scientific	G939
Dumont #5 forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Microscope immersion oil	Olympus	IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide	AmScope	MR095
MPPI-3 pressure injector	Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope	Olympus	SZ61
Back pressure unit	Applied Scientific Instrumentation	BPU
Micropipette holder kit	Applied Scientific Instrumentation	MPIP
Foot switch	Applied Scientific Instrumentation	FSW
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MM33
Magnetic base	Applied Scientific Instrumentation	Magnetic Base
Phenol red	Sigma-Aldrich	P-4758
Low temperature incubator	VWR	2020
SteREO Discovery.V12	Zeiss
Illuminator	Zeiss	HXP 200C
Cold light source	Zeiss	CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well	Mattek	P24G-0-13-F
Confocal microscope	Olympus	IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software	Olympus
Prism v6	GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus	Charles River	490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)	Charles River	490715
Influenza NS1-GFP			Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry)			Referenced in Lam et al. 2013