真菌による迅速な欠失生産<em>アグロバクテリウム</em> OSCAR削除コンストラクトの仲介された変換
Summary
相同組換えにより生成された遺伝子欠失突然変異体は、遺伝子機能研究のゴールドスタンダードである。削除構築物の迅速な生成のためのOSCAR（アグロバクテリウム – 組換え準備プラスミドのワンステップ構築）法が記載されている。 アグロバクテリウム媒介真菌形質転換が続く。最後に、真菌形質転換体における遺伝子欠失のPCRに基づく確認方法を提示する。
Abstract
残りのゲノムを変えずに目的の遺伝子を正確に欠失させることは、生物における特定の遺伝子の機能を決定するための理想的な産物を提供する。このプロトコルでは、正確で迅速な欠失プラスミド構築のOSCAR法が記載されている。 OSCARは、目的の遺伝子の精製されたPCR増幅5 'および3'側面および2つのプラスミド、pA-Hyg OSCAR（マーカーベクター）およびpOSCAR（組立体）を含む単一のリコンビナーゼ反応が行われるクローニングシステムに依存するベクター）。正しく組み立てられた欠失ベクターの確認は、制限消化マッピングとそれに続く配列決定によって行われる。 次いで、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いて、欠損構築物の真菌胞子への導入を仲介する（ATMTと呼ばれる）。最後に、相同組換えまたは非相同組換えによって組み込まれた欠失構築物が遺伝子欠失を示しているかどうかを決定するためのPCRアッセイが記載されている異所性の統合である。このアプローチは、 Verticillium dahliaeおよび他の種の中のFusarium verticillioidesにおける多数の遺伝子の欠失に首尾よく用いられている。
Introduction
遺伝的切開は、個々の遺伝子または遺伝子の組み合わせの機能的重要性を決定するための強力な方法論である。特定の遺伝子の役割を理解するための標準的なアプローチは、他のどの遺伝子でも改変されていない単一の遺伝子変異体の産生である。最も強力で潜在的に混乱を招くアプローチは、他の遺伝子機能を損なうことなく、関心対象のオープンリーディングフレーム（GOI ORF）の遺伝子を完全かつ正確に欠失させることである。
欠失プラスミド生成のための標準ライゲーションアプローチは複数のステップを必要とするので、OSCAR1の合理的な方がより迅速なインビトロアプローチを生成することであった。 図1は、OSCARアプローチにおけるアセンブリプロセスを示しています。本明細書に記載されている方法は、単一のマルチパート反応における個々の遺伝子欠失ベクターの迅速な構築と、その後のアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介トランスフェクションrmation（ATMT）。 OSCARは非常に迅速であり、酵母2におけるギブソンアセンブリの使用などの他の戦略とよく比較される。 OSCAR法は、いくつかの胞子嚢腫種（Ascomycota species ofcungi）と共に首尾よく使用されている。これらの種には以下のものが含まれる： Fusarium verticillioides （未発表）、 Verticillium dahliae 3 、Setophaeria turcica 4 、Metarhizium robertsii 5 、Fusarium oxysporum f。 sp。 vasinfectum 6 、Pestalotiopsis microspora 7 、Colletotrichum higginsianum 8 およびDothistroma septosporum 9およびSarocladium zeae （未公開）が含まれる。
このプロトコールは、プライマー設計、フランクPCR増幅、OSCAR BP反応、欠失構築物構造確認、形質転換を含む方法のための段階的な指示を提供するアグロバクテリウムのアグロバクテリウムイオンをコンストラクトと接触させ、続いて欠損構築物を真菌細胞にATMTベースで移し、最後に真菌の欠失突然変異体を異所的に組み込まれた欠失構築物と区別する。
Protocol
Representative Results
Discussion
アグロバクテリウムのワンステップ構築 – 絶滅のおそれのあるプラスミド（OSCAR）は、漸増する麹菌（Ascomycota fungi）の使用に成功しました。この方法はまた、 アグロバクテリウム媒介形質転換および相同組換えが可能であると仮定して、担子菌および他の真菌門由来の種（選択マーカー遺伝子を駆動する適切なプロモーターを有する）にも容易に適用可能であるべきである。抗…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、 Fusarium verticillioiodesの OSCAR突然変異体を作製するために、Anjellica Miller、Athar Naseer、Xiu Lin、Katelyn Woodburry、Chelsea Patterson、Kathleen Robertson、Krystina Bradley、Ashton Rogers、Alexis McKensie、Manny Hernandez 、Ashli Crepsac、Jeff Delong、Christian King、Gi Jeong、Maria Belding、Christy Burre、Daniel O'Meara、Lauren（Victoria）Cook、Jake Goodman、Sampriti De、Oge Okoye、Alyssa Beckstead、Garrett Hibbs、Nick Goldstein、Caroline Twum 、Chris Benson、Louis Stokes、Hannah Itell、Jane Hulse、Jasim Mohammed、James Loggins、Kelli Russell、Gre'Nisha Jones、Kristin Sheaffer、Mariam Hammady、Ava Wilson、カトリーナ・バズモア、トニー・ハーパー、カリン・マクギー、モハメド・モミン、リマ・モミンThi Ngoc Le、Angel Phamなどがあります。
Materials
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5 % agar if for solid medium | ||
| Co-cultivation medium | ATMT transformation induction (Reference 12) | ||
| Aspergillus minimal medium with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
| PDA medium | Acumedia | 7149A | Single spore slant tubes |
| PDA-Hyg-Kan medium | Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/ml hygromycin B and 100 μg/ml Kanamycin; | ||
| Glass beads | Genlantis | C400100 | Plate spreading |
| Nitrocellulose filters (47mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-culturing for ATMT |
| Various centifuge tubes | multiple preps | ||
| Petri plates (various) | Culturing of bacteria and Fungi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selectable marker vector |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
| DH5a One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reaction transformation |
| ccdB survival E. coli cells | Life Technologies | A10460 | Maintenance of pOSCAR |
| Wooden transfer sticks | Colony streaking | ||
| Toothpicks | Colony picking | ||
| Microcentrifuge | Pelleting Bacteria etc | ||
| Preparative centrifuge | Fungal spore collection | ||
| Dissecting microscope | Single spore isolation | ||
| Automated Cell Counter | Spore suspension calculation | ||
| Compound microscope | Hemocytometer cell counting | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purification |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxim | TCI America | C2224 | |
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post staining agarose gels |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Used to assemble deletion construct in pOSAR |
| PrimerQuest tool | IDT | Used in step 1.4; available on http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
Referências
- Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7 (7), (2011).
- Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).
- Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9 (9), (2014).
- Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
- Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).
- Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10 (5), e0125960 (2015).
- Chettri, P. . Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . , (2014).
- Chen Zhou, ., Yujun Yang, ., Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8 (2), 172 (1990).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S., Wang, K. a. n. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. 2, 403-420 (2007).
- Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).
- Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).
- McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 361-384 (2016).
