Produção de Deleção Rápida em Fungi via<em> Agrobacterium</em> Transformação mediada de construções de eliminação de OSCAR
Summary
Os mutantes de deleção de genes gerados através da recombinação homóloga são o padrão-ouro para estudos de função gênica. O método OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) para a geração rápida de construções de exclusão é descrito. A transformação fúngica mediada por Agrobacterium segue. Finalmente, é apresentado um método de confirmação baseado em PCR de deleções genéticas em transformantes fúngicos.
Abstract
Eliminação precisa de gene (s) de interesse, deixando o resto do genoma inalterado, fornece o produto ideal para determinar a função desse gene específico no organismo vivo. Neste protocolo, descreve-se o método OSCAR de construção de plasmídeos de deleção precisa e rápida. OSCAR depende do sistema de clonagem no qual uma única reação de recombinase é realizada contendo os flancos 5 'e 3' amplificados de PCR amplificados do gene de interesse e dois plasmídeos, pA-Hyg OSCAR (o vetor marcador) e pOSCAR (a assembléia vetor). A confirmação do vetor de deleção corretamente montado é realizada por mapeamento de digestão de restrição seguido de seqüenciamento. Agrobacterium tumefaciens é então usado para mediar a introdução da construção de deleção em esporos de fungos (referido como ATMT). Finalmente, um ensaio de PCR é descrito para determinar se a construção de deleção integrada por recombinação homóloga ou não homóloga, indicando deleção de gene ouIntegração ectopica, respectivamente. Esta abordagem foi utilizada com sucesso para a eliminação de numerosos genes em Verticillium dahliae e em Fusarium verticillioides entre outras espécies.
Introduction
A dissecção genética é uma metodologia poderosa para determinar a importância funcional de indivíduos ou combinações de genes. Uma abordagem padrão para entender o papel de genes específicos é a produção de mutantes de genes únicos inalterados em qualquer outro gene. A abordagem mais poderosa e menos potencialmente confusa é a deleção completa e precisa de um quadro de leitura aberto do gene de interesse (GOF ORF) sem danos a qualquer outra função genética.
Como as abordagens de ligadura padrão para a produção de plasmídeos de deleção requerem etapas múltiplas, o racional para OSCAR 1 era produzir uma abordagem in vitro mais rápida. A Figura 1 mostra o processo de montagem na abordagem OSCAR. O método descrito aqui tem a vantagem de combinar a construção rápida de vetores de deleção de genes individuais em uma única reação multipart em combinação com transfo mediado subseqüente Agrobacterium tumefaciens(ATMT). O OSCAR é muito rápido e compara-se bem com outras estratégias, como o uso da montagem de Gibson em leveduras 2 . O método OSCAR foi utilizado com sucesso com diversas espécies de fungos de Ascomycota. Essas espécies incluem: Fusarium verticillioides (não publicado), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 e Dothistroma septosporum 9 e Sarocladium zeae (não publicado) .
Este protocolo fornece instruções passo-a-passo para o método, incluindo design de iniciadores, amplificação de PCR de flanco, reação de OSCAR BP, confirmação de estrutura de construção de exclusão, transformaçãoIão de Agrobacterium com a construção seguida pela transferência baseada na ATMT da construção de deleção nas células de fungos e, finalmente, diferencia os mutantes de deleção de fungos daqueles com construções de exclusão ectopicamente integradas.
Protocol
Representative Results
Discussion
One Step Construction of Agrobacterium – Os plasmídeos prontos para reconstrução (OSCAR) foram empregados com sucesso com um número cada vez maior de fungos de Ascomycota. O método também pode ser facilmente aplicável à Basidiomycota e a espécies de outros filamentos fúngicos (com promotores apropriados que geram genes marcadores selecionáveis), assumindo que a transformação mediada por Agrobacterium e a recombinação homóloga são possíveis. Foram gerados vetores marcadores ad…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem aos seguintes estudantes de graduação e ensino médio por seu trabalho para gerar mutantes OSCAR em falsos verticillioiodes de Fusarium : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez Ashli Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin Thi Ngoc Le e Angel Pham.
Materials
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5 % agar if for solid medium | ||
| Co-cultivation medium | ATMT transformation induction (Reference 12) | ||
| Aspergillus minimal medium with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
| PDA medium | Acumedia | 7149A | Single spore slant tubes |
| PDA-Hyg-Kan medium | Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/ml hygromycin B and 100 μg/ml Kanamycin; | ||
| Glass beads | Genlantis | C400100 | Plate spreading |
| Nitrocellulose filters (47mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-culturing for ATMT |
| Various centifuge tubes | multiple preps | ||
| Petri plates (various) | Culturing of bacteria and Fungi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selectable marker vector |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
| DH5a One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reaction transformation |
| ccdB survival E. coli cells | Life Technologies | A10460 | Maintenance of pOSCAR |
| Wooden transfer sticks | Colony streaking | ||
| Toothpicks | Colony picking | ||
| Microcentrifuge | Pelleting Bacteria etc | ||
| Preparative centrifuge | Fungal spore collection | ||
| Dissecting microscope | Single spore isolation | ||
| Automated Cell Counter | Spore suspension calculation | ||
| Compound microscope | Hemocytometer cell counting | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purification |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxim | TCI America | C2224 | |
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post staining agarose gels |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Used to assemble deletion construct in pOSAR |
| PrimerQuest tool | IDT | Used in step 1.4; available on http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
Referências
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