Быстрое удаление продукта в грибах через<em> Agrobacterium</em> Опосредованное преобразование конструкций удаления ОСКАР
Summary
Мутанты делеции генов, продуцируемые посредством гомологичной рекомбинации, являются золотым стандартом для исследований функций генов. Описан метод OSCAR (одноступенчатое построение Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) для быстрой генерации делеционных конструкций. Последующая трансформация, связанная с Agrobacterium. Наконец, представлен метод подтверждения на основе ПЦР делеции генов в трансформантах грибов.
Abstract
Точное удаление интересующего гена (генов), оставляя остальную часть генома неизменным, обеспечивает идеальный продукт для определения функции конкретного гена в живом организме. В этом протоколе описан метод OSCAR точной и быстрой делеционной плазмидной конструкции. OSCAR опирается на систему клонирования, в которой проводится одна реакция рекомбиназы, содержащая очищенные ПЦР-амплифицированные 5 'и 3' фланки представляющего интерес гена и две плазмиды, pA-Hyg OSCAR (вектор маркера) и pOSCAR (сборка вектор). Подтверждение правильно собранного вектора удаления осуществляется путем преобразования рестрикционного переваривания с последующим секвенированием. Agrobacterium tumefaciens затем используют для опосредования введения делеционной конструкции в грибковые споры (называемые ATMT). Наконец, описан ПЦР-анализ, чтобы определить, включена ли делеционная конструкция, объединенная гомологичной или негомологичной рекомбинацией, указывая удаление гена илиЭктопическая интеграция, соответственно. Этот подход был успешно использован для делеции многочисленных генов в Verticillium dahliae и в Fusarium verticillioides среди других видов.
Introduction
Генетическая диссекция является мощной методологией для определения функциональной значимости отдельных или комбинаций генов. Стандартный подход к пониманию роли конкретных генов – это производство мутантов с одним геном, неизмененных в любом другом геном. Самым мощным и наименее потенциально запутанным подходом является полное и точное удаление открытой рамки считывания гена (GOI ORF) без повреждения любой другой функции гена.
Поскольку стандартные подходы к лигированию для образования делеционной плазмиды требуют нескольких этапов, рациональное для OSCAR 1 должно было обеспечить более быстрый подход in vitro . На рисунке 1 показан процесс сборки в подходе OSCAR. Описанный здесь способ имеет преимущество сочетания быстрой конструирования отдельных векторов делеции генов в одной множественной реакции в сочетании с последующим агробактерием tumefaciens, опосредованным transfo(ATMT). OSCAR очень быстрый и хорошо сравнивается с другими стратегиями, такими как использование сборки Gibson в дрожжах 2 . Метод OSCAR успешно использовался с несколькими видами грибов Ascomycota. Эти виды включают: Fusarium verticillioides (неопубликованные), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. зр. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 и Dothistroma septosporum 9 и Sarocladium zeae (неопубликованные) .
Этот протокол обеспечивает пошаговую инструкцию для метода, включающего в себя схему праймера, фланковую ПЦР-амплификацию, реакцию OSCAR BP, подтверждение структуры конструкции удаления, трансформациюИон Agrobacterium с конструкцией, за которой следует перенос делеционной конструкции на ATMT в грибковые клетки, и, наконец, дифференцировать мутанты делеции грибов от тех, которые имеют эктопически интегрированные делеционные конструкции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одноступенчатое конструирование плазмид Agrobacterium-Recombination-ready-PLASID (OSCAR) было успешно использовано с постоянно растущим числом грибов Ascomycota. Этот метод также может быть легко применим к Basidiomycota и видам из других грибковых фил (с соответствующими промоторами, управляющими селектируемы…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят следующих студентов и старшеклассников за их работу по созданию мутантов OSCAR в Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez , Эшли Крепсак, Джефф Деланг, Христианский король, Джи Чжон, Мария Беллинг, Кристи Берре, Даниэль О'Мира, Лорен (Виктория) Кук, Джейк Гудман, Самприти Де, Оге Окой, Алисса Бекстед, Гарретт Хиббс, Ник Гольдштейн, Кэролайн Твайм , Крис Бенсон, Луис Стокс, Ханна Ителл, Джейн Хьюлс, Джасим Мохаммед, Джеймс Логгинс, Келли Рассел, Грениша Джонс, Кристин Шеффер, Мариам Хаммади, Ава Уилсон, Катрина Баземоре, Тони Харпер, Карлин МакГи, Мохмед Момин, Рима Момин , Thi Ngoc Le и Angel Pham.
Materials
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5 % agar if for solid medium | ||
| Co-cultivation medium | ATMT transformation induction (Reference 12) | ||
| Aspergillus minimal medium with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
| PDA medium | Acumedia | 7149A | Single spore slant tubes |
| PDA-Hyg-Kan medium | Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/ml hygromycin B and 100 μg/ml Kanamycin; | ||
| Glass beads | Genlantis | C400100 | Plate spreading |
| Nitrocellulose filters (47mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-culturing for ATMT |
| Various centifuge tubes | multiple preps | ||
| Petri plates (various) | Culturing of bacteria and Fungi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selectable marker vector |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
| DH5a One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reaction transformation |
| ccdB survival E. coli cells | Life Technologies | A10460 | Maintenance of pOSCAR |
| Wooden transfer sticks | Colony streaking | ||
| Toothpicks | Colony picking | ||
| Microcentrifuge | Pelleting Bacteria etc | ||
| Preparative centrifuge | Fungal spore collection | ||
| Dissecting microscope | Single spore isolation | ||
| Automated Cell Counter | Spore suspension calculation | ||
| Compound microscope | Hemocytometer cell counting | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purification |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxim | TCI America | C2224 | |
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post staining agarose gels |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Used to assemble deletion construct in pOSAR |
| PrimerQuest tool | IDT | Used in step 1.4; available on http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
Referências
- Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7 (7), (2011).
- Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).
- Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9 (9), (2014).
- Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
- Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).
- Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10 (5), e0125960 (2015).
- Chettri, P. . Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . , (2014).
- Chen Zhou, ., Yujun Yang, ., Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8 (2), 172 (1990).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S., Wang, K. a. n. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. 2, 403-420 (2007).
- Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).
- Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).
- McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 361-384 (2016).
