Rapid Deletion Production in Fungi via<em> Agrobacterium</em> Medierad transformation av OSCAR Deletion Constructs
Summary
Gendeletionsmutanter som alstras genom homolog rekombination är guldstandarden för genfunktionsstudier. OSCAR (One Step Construction av Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) -metoden för snabb generering av deletionskonstruktioner beskrivs. Agrobacterium- medierad svamptransformation följer. Slutligen presenteras en PCR-baserad bekräftelsemetod av gendeletioner i svamptransformanter.
Abstract
Exakt deletion av gen (er) av intresse, medan resten av genomet oförändras, ger den idealiska produkten för att bestämma den specifika genens funktion i den levande organismen. I detta protokoll beskrivs OSCAR-metoden för exakt och snabb deletionsplasmidkonstruktion. OSCAR är beroende av kloningssystemet där en enda rekombinasreaktion utförs innehållande de renade PCR-amplifierade 5'- och 3'-flankerna av den aktuella genen och två plasmider, pA-Hyg OSCAR (markörvektorn) och pOSCAR (enheten vektor). Bekräftelse av den korrekt monterade deletionsvektorn utförs genom restriktionsmeltningskartläggning följt av sekvensering. Agrobacterium tumefaciens används sedan för att mediera införandet av deletionskonstruktionen i svampsporer (hänvisad till som ATMT). Slutligen beskrivs en PCR-analys för att bestämma om deletionskonstruktionen integreras genom homolog eller icke-homolog rekombination, indikerande gengenetion ellerEktopisk integration, respektive. Denna metod har framgångsrikt använts för att radera flera gener i Verticillium dahliae och i Fusarium verticillioides bland andra arter.
Introduction
Genetisk dissektion är en kraftfull metod för att bestämma individens funktionella betydelse eller kombinationer av gener. En standardinriktning för att förstå rollen av specifika gener är produktion av enkla genmutanter som oförändrats i någon annan gen. Det mest kraftfulla och minst potentiellt konfronterande tillvägagångssättet är fullständigt och exakt deletion av en gen av intresseens öppna läsram (GOI ORF) utan skada på någon annan genfunktion.
Eftersom standardiseringsmetoder för deletionsplasmidgenerering kräver flera steg, var det rationella för OSCAR 1 att producera en snabbare in vitro -tillvägagångssätt. Figur 1 visar monteringsprocessen i OSCAR-metoden. Förfarandet som beskrivs här har fördelen att kombinera snabb konstruktion av individuella gendeletionsvektorer i en enda multipartreaktion i kombination med efterföljande Agrobacterium tumefaciens- medierad transfoRmation (ATMT). OSCAR är mycket snabb och jämför bra med andra strategier, såsom användning av Gibson-montering i jäst 2 . OSCAR-metoden har använts framgångsrikt med flera Ascomycota-svamparter. Dessa arter inkluderar : Fusarium verticillioides (opublicerad), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 och Dothistroma septosporum 9 och Sarocladium zeae (opublicerad) .
Detta protokoll tillhandahåller steg för steg instruktion för metoden inkluderande primerdesign, flank-PCR-amplifiering, OSCAR BP-reaktion, deletionskonstruktionsbekräftelse, transformatJon av Agrobacterium med konstruktionen följt av ATMT-baserad överföring av deletionskonstruktionen i svampcellerna och slutligen differentierar svampdeletionsmutanter från de med ektopiskt integrerade deletionskonstruktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enstegsbyggande av Agrobacterium- Recombination-ready-plasmids (OSCAR) har framgångsrikt använts med ett ständigt ökande antal Ascomycota-svampar. Metoden bör också lätt kunna tillämpas på basidiomycotan och arten från andra svampfyla (med lämpliga promotorer som driver selekterbara markörgener), förutsatt att Agrobacterium- medierad transformation och homolog rekombination är möjliga. Ytterligare markörvektorer har genererats för att diversifiera val av anti-svampförening sa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar följande grund- och gymnasieelever för deras arbete att generera OSCAR-mutanter i Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez Ashle Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum , Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le och Angel Pham.
Materials
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5 % agar if for solid medium | ||
| Co-cultivation medium | ATMT transformation induction (Reference 12) | ||
| Aspergillus minimal medium with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
| PDA medium | Acumedia | 7149A | Single spore slant tubes |
| PDA-Hyg-Kan medium | Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/ml hygromycin B and 100 μg/ml Kanamycin; | ||
| Glass beads | Genlantis | C400100 | Plate spreading |
| Nitrocellulose filters (47mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-culturing for ATMT |
| Various centifuge tubes | multiple preps | ||
| Petri plates (various) | Culturing of bacteria and Fungi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selectable marker vector |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
| DH5a One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reaction transformation |
| ccdB survival E. coli cells | Life Technologies | A10460 | Maintenance of pOSCAR |
| Wooden transfer sticks | Colony streaking | ||
| Toothpicks | Colony picking | ||
| Microcentrifuge | Pelleting Bacteria etc | ||
| Preparative centrifuge | Fungal spore collection | ||
| Dissecting microscope | Single spore isolation | ||
| Automated Cell Counter | Spore suspension calculation | ||
| Compound microscope | Hemocytometer cell counting | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purification |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxim | TCI America | C2224 | |
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post staining agarose gels |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Used to assemble deletion construct in pOSAR |
| PrimerQuest tool | IDT | Used in step 1.4; available on http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
Referências
- Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7 (7), (2011).
- Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).
- Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9 (9), (2014).
- Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
- Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).
- Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10 (5), e0125960 (2015).
- Chettri, P. . Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . , (2014).
- Chen Zhou, ., Yujun Yang, ., Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8 (2), 172 (1990).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S., Wang, K. a. n. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. 2, 403-420 (2007).
- Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).
- Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).
- McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 361-384 (2016).
