Yoluyla mantarlarda hızlı Silme Üretimi<em> Agrobacterium</em> OSCAR Silme Yapılarının Aracı Dönüştürülmesi
Summary
Homolog rekombinasyon yoluyla üretilen gen silme mutantları, gen fonksiyonu çalışmaları için altın standarttır. Silme yapılarının hızlı oluşturulması için OSCAR (Agrobacterium-Rekombinasyona hazır plasmidler'in Bir Adımlı Yapısı) yöntemi anlatılmıştır. Agrobacterium aracılı fungal transformasyon izlenir. Son olarak, fungal transformantlarda gen çıkarılmalarının PCR tabanlı onay yöntemi.
Abstract
Gereksinim genini geri kalanını değiştirmeden kesin bir şekilde çıkarmak, canlıdaki organizmada belirli bir genin işlevini belirlemek için ideal bir ürün sağlar. Bu protokolde, hassas ve hızlı silme plazmid konstrüksiyonu OSCAR yöntemi anlatılmıştır. OSCAR, ilgilenilen genin saflaştırılmış PCR ile güçlendirilmiş 5 've 3' yanları ve pA-Hyg OSCAR (işaretleyici vektör) ve pOSCAR (birleştirme grubu) olmak üzere tek bir rekombinaz reaksiyonunun gerçekleştirildiği klonlama sistemine dayanmaktadır. vektör). Doğru monte edilen silme vektörünün doğrulanması, kısıtlama sindirim haritalaması ve bunu takiben sıralama ile gerçekleştirilir. Agrobacterium tumefaciens daha sonra silme yapısının fungal sporlara (ATMT olarak anılacaktır) yönlendirilmesine aracılık etmek için kullanılır. Son olarak, silme yapısının homolog veya homolog olmayan rekombinasyon ile entegre edilip edilmediğini belirlemek için bir PCR testi tarif edilmiştir, bu, gen silinmesini veyaSırasıyla ektopik entegrasyon. Bu yaklaşım Verticillium dahliae'de ve Fusarium verticillioides'de diğer türler arasında çok sayıda genin silinmesi için başarıyla kullanılmaktadır .
Introduction
Genetik diseksiyon, bireylerin veya gen kombinasyonlarının fonksiyonel önemini belirlemek için güçlü bir metodolojidir. Spesifik genlerin rolünü anlamak için standart bir yaklaşım, başka herhangi bir gende değiştirilmemiş tek gen mutantlarının üretilmesidir. En güçlü ve en az potansiyel olarak karıştırıcı yaklaşım, başka bir gen fonksiyonuna zarar vermeden, ilgi alanının açık okuma çerçevesinin (GOI ORF) eksiksiz ve kesin bir şekilde silinmesidir.
Silme plasmidinin üretilmesi için standart ligasyon yaklaşımları çoklu adımları gerektirdiğinden, OSCAR 1 için rasyonel , in vitro daha hızlı bir yaklaşım üretmektir. Şekil 1 OSCAR yaklaşımındaki montaj sürecini göstermektedir. Burada açıklanan yöntem, bireysel gen silme vektörlerinin hızlı yapımını, tekli çok parçalı bir reaksiyonda, sonraki Agrobacterium tumefaciens aracılı transfo ile kombinasyon halinde birleştirmenin avantajına sahiptirRmation (ATMT). OSCAR çok hızlıdır ve maya 2'de Gibson grubunun kullanımı gibi diğer stratejilerle iyi bir karşılaştırma yapmaktadır. OSCAR yöntemi, birkaç Ascomycota mantar türü ile başarıyla kullanılmıştır. Bu türler şunları içerir: Fusarium verticillioides (yayımlanmamış), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 ve Dothistroma septosporum 9 ve Sarocladium zeae (yayınlanmamış) .
Bu protokol, primer tasarımı, flank PCR amplifikasyonu, OSCAR BP reaksiyonu, silme yapısı yapısı onayı, transformat gibi yöntem için adım adım talimat sağlarİyonunu Agrobacterium'un yapısı ile, ardından da silme konstruktunun mantar hücrelerine ATMT'ye dayalı olarak aktarılmasını ve nihayet mantar delesyon mutantlarını ektopik olarak entegre edilmiş silme yapılarıyla olanlardan ayırt eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir Adım Agrobacterium Yapısı -Rekombinasyona hazır plazmid (OSCAR), gittikçe artan sayıda Ascomycota mantarları ile başarıyla kullanılmıştır. Yöntem, Basidiomycota'ya ve diğer fungal filumlardan (seçilebilir markör genleri sürükleyen uygun promotörler ile birlikte) olan türlere, Agrobacterium aracılı transformasyon ve homolog rekombinasyonun mümkün olduğunu varsayarak kolayca uygulanabilir olmalıdır. Anti-mantar bileşiğinin seçeneklerini çeşitlendirmek ve çift ve …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Fusarium verticillioiodes'de OSCAR mutantları üretmek için yaptıkları çalışmalar için aşağıdaki lisans ve lise öğrencilerine teşekkür ederler : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez , Ashle Crepsac, Jeff Delong, Christie Burre, Christie Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum , Chris Benson, Louis Stokes, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le ve Angel Pham.
Materials
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5 % agar if for solid medium | ||
| Co-cultivation medium | ATMT transformation induction (Reference 12) | ||
| Aspergillus minimal medium with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
| PDA medium | Acumedia | 7149A | Single spore slant tubes |
| PDA-Hyg-Kan medium | Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/ml hygromycin B and 100 μg/ml Kanamycin; | ||
| Glass beads | Genlantis | C400100 | Plate spreading |
| Nitrocellulose filters (47mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-culturing for ATMT |
| Various centifuge tubes | multiple preps | ||
| Petri plates (various) | Culturing of bacteria and Fungi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selectable marker vector |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
| DH5a One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reaction transformation |
| ccdB survival E. coli cells | Life Technologies | A10460 | Maintenance of pOSCAR |
| Wooden transfer sticks | Colony streaking | ||
| Toothpicks | Colony picking | ||
| Microcentrifuge | Pelleting Bacteria etc | ||
| Preparative centrifuge | Fungal spore collection | ||
| Dissecting microscope | Single spore isolation | ||
| Automated Cell Counter | Spore suspension calculation | ||
| Compound microscope | Hemocytometer cell counting | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purification |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxim | TCI America | C2224 | |
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post staining agarose gels |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Used to assemble deletion construct in pOSAR |
| PrimerQuest tool | IDT | Used in step 1.4; available on http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
Referências
- Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7 (7), (2011).
- Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).
- Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9 (9), (2014).
- Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
- Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).
- Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10 (5), e0125960 (2015).
- Chettri, P. . Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . , (2014).
- Chen Zhou, ., Yujun Yang, ., Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8 (2), 172 (1990).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S., Wang, K. a. n. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. 2, 403-420 (2007).
- Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).
- Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).
- McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 361-384 (2016).
