Biofysiska karakterisering av flagellar motorik
Summary
Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.
Abstract
The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.
Introduction
Flagellar motorer möjliggör cellerna att simma genom att vrida spiralextracellulära filament. Mängden vridmoment motorn kan generera för en given längd av flagellen (dvs den viskösa belastningen) bestämmer simning hastigheter. Å andra sidan, styr dess förmåga att byta rotationsriktning cellmigration som svar på kemikalier, en process som kallas kemotaxi. Kemotaxi och rörlighet är virulensfaktorer 1-3, flagellar motorer har väl karakteriserad under åren 4. Montering tyder nu att motorn fungerar som en mechanosensor – det mekaniskt detekterar närvaron av fasta substrat 5,6. Denna förmåga hjälper sannolikt utlösa yta kolonisering och infektioner 5,7. Som ett resultat, de mekanismer varigenom motorn avkänner ytor och initierar signalering har betydelse 8,9.
Den flagellar motor kan lätt studeras genom uppbundna den flagellum på ett substrat och observation cell rotation. Sådan uppbindning först uppnås genom Silverman och Simon, som arbetade med en polyhook mutant i E. coli och framgångsrikt fästa krokar till glassubstrat med anti-hook-antikroppar 10. Analysen tjudrad-cell aktiverad forskare att studera svaren från motorbrytaren till en mängd olika kemiska stimuli. Till exempel, Segall och medarbetare kemiskt stimulerade bundna celler med hjälp av jontoforetiska pipetter. Motsvarande förändringar i CW partiskhet (den bråkdel av den tid motorerna snurra medurs CW) möjligt för dem att mäta kinetiken av anpassning i kemotaxi nätet 11,12. Medan den bundna cellanalysen var effektiv i att studera switch svar, var det endast möjlighet att erbjuda en inblick i motormekanik över ett begränsat område av viskösa belastningar 13. För att lösa detta problem, Ryu och medarbetare bundna sfäriska, latexpärlor till glödtråden stubbar på celler fastnat ytor. Pärlornasedan spåras med hjälp back-focal interferometri med svaga optiska fällor 14. Genom att arbeta med pärlor av olika storlekar, kan forskarna studera motorn över ett mycket bredare spektrum av laster. Denna analys senare förbättrades med Yuan och Berg, som utvecklade en fotomultiplikator baserad bead-spårningsteknik i kombination med lasermörkfältsbelysning. Deras metod aktiverat spårning av bundna guld nanobeads som var så liten (~ 60 nm) att de externa viskösa motstånd var lägre jämfört med de inre viskösa motstånd till rotation 15,16. Detta ledde till att mätningar av de högsta uppnåeliga hastigheter i E. coli (~ 300 Hz). I V. alginolyticus, liknande pärla analyser aktiverade mätningar av spinnhastigheter vid mellanliggande viskösa laster (~ 700 Hz) 17. Genom att aktivera mätningar av motoriska gensvar över hela möjliga utbud av viskösa laster (från noll-belastning till nära-stall), pärlan-analyserna gav en viktig biofysiska verktyg för att förstå torque-genereringsprocessen 18,19.
Nyligen ändrade vi Yuan-Berg analys för att inkludera optisk pincett som möjligt för oss att tillämpa exakta mekaniska stimuli till individuella motorer 6. Med denna teknik, visade vi att kraftgeneratorer som roterar motorn är dynamiska mechanosensors – de renovera som svar på förändringar i viskösa laster. Det är möjligt att en sådan lastkännande utlöser celldifferentiering in i svärmar bakterier, även om mekanismerna är fortfarande oklara. Det är också troligt att de flagellar motorer i andra arter är också mechanosensitive 20, fastän direkta bevis saknas. Här diskuterar vi fotomultiplikatorn baserade (PMT) inställning för att spåra rotation av latexpärlor bundna till flagellar filament 15. I jämförelse med spårning med ultrasnabba kameror, är fotomultiplikator-setup fördelaktig eftersom den är relativt enkelt att spåra enskilda pärlor i realtid och över långa durationer. Det är särskilt användbart när man studerar länge ombyggnad i flagellar motor komplex på grund av miljö stimuli 21. Även om vi specificera protokoll specifikt för E. coli, kan de lätt anpassas för att studera flagellära motorer i andra arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att underlätta tjudrad pärla-spårning och korrekt uppskattning av motormoment bör följande uppgifter ses över. När du utför dessa mätningar med flagelle celler, är klippning ett kritiskt steg. Skjuvning minskar flagellära filament till en ren stub, därigenom säkerställa att den viskösa belastningen på motorn är övervägande beror på pärlan och kan uppskattas inom 10% fel 16. Klippning förbättrar också chanserna att hitta cirkulära banor med tätt fördelade excentriciteter (<p?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Howard Berg for the gift of the bead-tracking microscope/photomultipliers and the Texas A&M Engineering Experiment Station for funds.
Materials
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 ml Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3×1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
Referências
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
- Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
- Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
- Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
- Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).
- Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
- Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
- Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
- Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
- Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
- Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
- Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
- Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
- Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. Response thresholds in bacterial chemotaxis. Sci Adv. 1 (9), e1500299 (2015).
- Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
- Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
- Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
- Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
- Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).
