Caratterizzazione biofisica delle funzioni flagellare a motore
Summary
Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.
Abstract
The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.
Introduction
I motori flagellare consentono alle cellule di nuotare ruotando filamenti extracellulari elicoidali. La quantità di coppia del motore può generare per una data lunghezza del flagello (cioè, il carico viscoso) determina le velocità di nuoto. D'altro canto, la capacità di cambiare la direzione di rotazione controlla migrazione delle cellule in risposta ad agenti chimici, un processo noto come chemiotassi. Chemiotassi e la motilità di essere fattori di virulenza 1-3, motori flagellare sono stati ben caratterizzati nel corso degli anni 4. Prove di montaggio ora suggerisce che il motore funge mechanosensor – rileva meccanicamente la presenza di substrati solidi 5,6. Questa capacità aiuta probabilmente a scatenare la colonizzazione della superficie e le infezioni 5,7. Di conseguenza, i meccanismi per cui il motore individua automaticamente superfici e iniziati segnalazione sono di importanza 8,9.
Il motore flagellare può essere facilmente studiato da legare il flagellum ad un substrato e osservando la rotazione cellulare. Tale tethering è stato raggiunto prima da Silverman e Simon, che lavorava con un mutante polyhook in E. coli e ganci fissati con successo per substrati di vetro con anticorpi anti-gancio 10. Il test legato celle consentito ai ricercatori di studiare le risposte del motore interruttore ad una varietà di stimoli chimici. Ad esempio, Segall e collaboratori stimolati chimicamente le cellule in collegamento, con l'ausilio di pipette iontoforesi. I cambiamenti corrispondenti pregiudizi CW (la frazione dei motori tempo di rotazione in senso orario, CW) ha permesso loro di misurare le cinetiche di adattamento della rete chemiotassi 11,12. Mentre il test delle cellule legato è stato efficace nello studio delle risposte degli interruttori, è stato solo in grado di offrire intuizioni meccanica del motore su una gamma limitata di carichi viscosi 13. Per superare questo problema, Ryu e collaboratori impastoiati sferiche, sfere di lattice a filamento stub su cellule attaccate alle superfici. Le perle sono statipoi monitorati tramite interferometria back-focale con trappole ottiche deboli 14. Lavorando con perline di diverse dimensioni, i ricercatori possono studiare il motore su una gamma più ampia di carichi. Questo test è stato poi migliorato da Yuan e Berg, che ha sviluppato una tecnica di tallone-tracking fotomoltiplicatore a base combinata con illuminazione laser in campo scuro. Il loro metodo attivato il monitoraggio di nanobeads frenati d'oro che erano così piccola (~ 60 nm) che le resistenze viscose esterni sono stati inferiori rispetto alle resistenze viscose interne a rotazione 15,16. Ciò ha portato alle misure delle velocità massime ottenibili in E. coli (~ 300 Hz). In V. alginolyticus, simili saggi di perline attivate misure dei tassi di filatura a carichi intermedi viscosi (~ 700 Hz) 17. Consentendo misurazioni di risposte motorie sull'intera gamma possibile di carichi viscosi (da zero-carico quasi stallo), le perline-saggi fornito un importante strumento biofisico per comprendere il tprocesso orque generazione 18,19.
Recentemente, abbiamo modificato il dosaggio Yuan-Berg per includere pinzette ottiche che ci hanno permesso di applicare stimoli meccanici precisi per singoli motori 6. Usando questa tecnica, abbiamo dimostrato che la forza-generatori che ruotano il motore sono meccanosensori dinamici – si rimodellare in risposta ai cambiamenti di carichi viscosi. È possibile che tale load sensing innesca differenziazione cellulare nei batteri brulicanti, sebbene i meccanismi rimangono poco chiari. E 'anche probabile che i motori flagellare in altre specie sono anche meccanosensibili 20, anche se la prova diretta è carente. Qui, si discute l'approccio fotomoltiplicatore-based (PMT) per il monitoraggio della rotazione delle sfere di lattice impastoiati ai filamenti flagellari 15. Rispetto al monitoraggio con telecamere ultraveloci, il fotomoltiplicatore-setup è vantaggioso perché è relativamente semplice per tenere traccia delle singole perle in tempo reale e più a lungo durazioni. E 'particolarmente utile quando si studia a lungo tempo rimodellamento in complessi a motore flagellare a causa di stimoli ambientali 21. Anche se abbiamo protocolli dettaglio specifico per E. coli, che possono essere facilmente adattati per lo studio di motori flagellare in altre specie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al fine di facilitare tethered tallone-tracking e stima corretta del motore coppie, le seguenti informazioni dovrebbe essere rivisto. Quando si eseguono queste misure con cellule flagellate, tosatura è un passaggio fondamentale. Shearing riduce la flagellar filamento ad un semplice stub, garantendo così che il carico sul motore viscosa è prevalentemente dovuta al tallone e può essere stimato entro l'errore 10% 16. Shearing migliora anche la possibilità di trovare le traiettorie circolari con eccentri…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Howard Berg for the gift of the bead-tracking microscope/photomultipliers and the Texas A&M Engineering Experiment Station for funds.
Materials
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 ml Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3×1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
Referências
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