تحليل فصل الكروموسوم، هيستون أستيلاتيون، و مورفولوجيا المغزل في البويضات الحصان
Summary
تصف هذه المخطوطة نهجا تجريبيا لتوصيف البويضات الحصانية شكليا وبيولوجيا كيميائيا. على وجه التحديد، ويوضح العمل الحالي كيفية جمع البويضات الحصان غير ناضجة وناضجة عن طريق الموجات فوق الصوتية الموجهة البيك البيك اب (أوبو) وكيفية التحقيق الفصل الكروموسوم، مورفولوجيا المغزل، هيستون العالمية هيستيون، والتعبير مرنا.
Abstract
وقد تم تطوير مجال المساعدة على الإنجاب لعلاج العقم لدى النساء والحيوانات المصاحبة والأنواع المهددة بالانقراض. في الحصان، كما يسمح الاستنساخ بمساعدة لإنتاج الأجنة من الأداء العالي دون انقطاع حياتهم الرياضية ويسهم في زيادة في عدد من المهرات من الفرس ذات القيمة الوراثية العالية. يصف المخطوطة الحالية الإجراءات المستخدمة لجمع البويضات غير الناضجة والناضجة من المبيض الحصان باستخدام البيضة البيك اب (أوبو). ثم استخدمت هذه البويضات للتحقيق في حدوث أنيوبلوادي عن طريق تكييف بروتوكول وضعت سابقا في الفئران. على وجه التحديد، كانت الكروموسومات و سينتروميرس من الطور الثاني البويضات (مي) فلورزنتلي المسمى وتحسب على خطط التنسيق متتابعة بعد متحد البؤر المجهر ليزر المسح الضوئي. وكشف هذا التحليل عن حدوث أعلى في معدل أنيوبلوادي عندما تم جمع البويضات غير ناضجة من المسام ونضجت في المختبر مقارنة معفي الجسم الحي. المناعية للأنبوبين وشكل أستيل من هيستون أربعة في مخلفات يسين محددة كشفت أيضا الاختلافات في مورفولوجيا المغزل الانتصافي وفي النمط العالمي من أستيون هيستون. وأخيرا، تم التحقيق في التعبير عن ترميز مرناس لهستون ديستيلاسيس (هداس) وأسيتيل-ترانسفاسيس (هاتس) عن طريق النسخ العكسي والكمي ير (ف ير). لم تلاحظ أي اختلافات في التعبير النسبي للنصوص بين في المختبر وفي الجسم الحي نضجت البويضات. في اتفاق مع إسكات العام للنشاط النسخي خلال النضج البويضة، وتحليل مجموع المبلغ نص يمكن أن تكشف فقط استقرار مرنا أو تدهور. ولذلك، فإن هذه النتائج تشير إلى أن الأنظمة الأخرى متعدية وبعد متعدية قد تتأثر.
وعموما، فإن هذه الدراسة تصف نهجا تجريبيا ل مورفولوجيا و بيوشيميكالي وصف بويضة الحصان، و سيليرة لبنانية نوع من الصعب للغاية لدراسة بسبب انخفاض توافر عينة. ومع ذلك، فإنه يمكن توسيع معرفتنا على البيولوجيا التناسلية والعقم في الأنواع أحادي.
Introduction
وقد تم تطوير مجموعة واسعة من تقنيات المساعدة على الإنجاب لعلاج العقم لدى النساء والحيوانات المصاحبة والأنواع المهددة بالانقراض. واحدة من الإجراءات الأكثر شيوعا في البيئات السريرية هو استرجاع الطور الثاني (مي) البويضات -stage من الجريبات المبيض عن طريق الموجات فوق الصوتية الموجهة المهبل المهبل، البيضاوي البيك اب (أوبو) 1 . ثم يتم تسميد هذه البويضات في المختبر (إيف)، مع الجنين الناتجة (ق) زرعها في الرحم المستلم. يتم استرجاع البويضات مرحلة مي (ناضجة) بعد إدارة الغدد التناسلية الخارجية. ومع ذلك، يرتبط هذا العلاج، في بعض المرضى، مع تطور متلازمة فرط المبيض (أوهس) 2 .
الاستفادة من القدرة الذاتية من نمت بشكل كامل، البويضات غير ناضجة (GV- مرحلة) لاستئناف عفوية الانقسام الاختزالي مرة واحدة معزولة عن بصيلاتهم، فمن الممكن الحصول على البويضات ناضجة دون أدمينيستيرون الغدد التناسلية 3 . ويسمى هذا الإجراء البويضات في النضج المختبر (إيفم) ويمثل أقل موجهة نحو المخدرات، وأقل تكلفة، وأكثر ملاءمة للمريض نهج لمساعدة التكنولوجيا الإنجابية. ومع ذلك، فإن نجاح تطوير الجنين مع البويضات في المختبر -matured أقل عموما من مع في الجسم الحي نضجت البويضات 4 ، 5 . تفسير محتمل هو أن في المختبر نضجت البويضات هي أكثر تضررا من الأخطاء في الفصل الكروموسوم، و أنيوبلوادي يؤدي إلى إعاقة التطور الجنيني الطبيعي 6 .
وفهم الأساس الجزيئي من الكروموسومات سوء الفصل أثناء إيفم الكشف في نهاية المطاف عن الإمكانات الكاملة لهذه التقنية. في هذا السياق، استخدم المنهج التجريبي للتحقيق في السمات المورفولوجية والبيوكيميائية للبويضات في المختبر -mureded، مقارنة مع في الجسم الحي نضجيتم وصف البويضات إد هنا 7 ، 8 . على وجه التحديد، يتم توضيح إجراءات ل أوبو من البويضات غير ناضجة وناضجة و إيفم من البويضات غير الناضجة باستخدام الخيول الكبار والطبيعة بشكل طبيعي كنموذج تجريبي. ثم، يتم استخدام المناعي وتحليل الصورة للتحقيق الكروموسوم الفصل، مورفولوجيا المغزل، والنمط العالمي من أستيون هيستون على هذه غاميتس. وأخيرا، وصف بروتوكول من النسخ العكسي وكمية ير لتحليل التعبير مرنا.
وبالمقارنة مع النماذج الحيوانية القوارض، والخيول لا تسمح التلاعب الجيني، هي أقل سهولة للتلاعب، وتتطلب صيانة باهظة الثمن. ومع ذلك، فإن هذا النموذج يكتسب اهتماما كبيرا لدراسة النضج البويضة 9 ، 10 بسبب تشابه لعلم وظائف الأعضاء المبيض الإنسان 11 ، 12 </ سوب>. وعلاوة على ذلك، فإن وضع بروتوكولات موثوقة من إيفم-إيف في الحصان له مصلحة اقتصادية كبيرة، لأنها تسمح لزيادة في عدد من المهرات من الفرس من القيمة الجينية العالية.
واحدة من القيود المفروضة على إجراء التجارب على البويضات، وخاصة في الأنواع أحادي، هو توافر عينة مقيدة. وقد تم التغلب على هذا الحد هنا عن طريق تعديل نهج، وضعت سابقا في الفئران، لبويضات الحصان 13 ، 14 من أجل إجراء العد الكروموسوم الذي يقلل من فقدان العينة (انظر المناقشة للمقارنة مع التقنيات المتاحة الأخرى). وعلاوة على ذلك، تم تحسين بروتوكول تلطيخ الثلاثي مضان لإجراء تحليلات متعددة على نفس العينة، وأجريت التحليلات q- ير على برك من 2 البويضات فقط.
وعموما، فإن هذه الدراسة تصف نهجا تجريبيا يهدف إلى تشورفيا و تشيميا كيميائياراكتريز البويضة الحصان، وهو نوع من الخلايا التي هي صعبة للغاية للدراسة بسبب توفر عينة منخفضة. ومع ذلك، فإنه يمكن توسيع معرفتنا في البيولوجيا التناسلية والعقم من الأنواع أحادي.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن إيفم قد أجريت في الخيول لأكثر من 20 عاما 16 ، ونحن لا نعرف حتى الآن ما إذا كان البويضة يمكن أن يكون أصل أنيوبلوادي الغدة الجنينية، كما اقترح للبشر 17 . والسبب هو على الأرجح أن إعداد ينتشر البويضة لنتائج العد الكروموسوم في فقدان عي?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا فابريس فنسنت على الدعم الذي قدمه مع المسح الضوئي المجهري البؤري بالليزر (لم) ، وفليب بارير وتييري بلارد لأداء المسح المبيض بالموجات فوق الصوتية يوميا وحقن قوات حرس السواحل الهايتية. وأيد هذا العمل جزئيا مشروع "ريجيون سارديغنا أند ريجيون لومبارديا" "إكس أوفو أومنيا" (المنحة رقم 26096200 إلى مكافحة غسل الأموال). (العقد 2012 إلى فف)، FP7-بيوبل-2011- سيغ، الوكالة التنفيذية للبحوث (ريا) "برو-أوفوم" (المنحة رقم 303640 إلى فل)، و FP7-بيوبل-2011- سيغ. ومدرسة ما بعد الدكتوراه في الزراعة والطب البيطري، بتمويل مشترك من الصندوق الاجتماعي الأوروبي، البرنامج التشغيلي القطاعي لتنمية الموارد البشرية للفترة 2007-2013 (العقد رقم بوسدرو / 89 / 1.5 / S / 62371 إلى إدارة المعلومات). تم تمويل جمع البويضات في الجسم الحي من قبل معهد فرانسيس دو تشيفال إت دي l'إكيتاتيون.
Materials
| ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
| human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
| detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
| butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
| stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
| butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
| benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
| TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
| Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
| 4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
| incubator | Heraeus | BB6060 | |
| monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
| TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
| Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
| ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
| mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
| rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
| AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
| Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
| mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
| SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
| specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
| thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
| mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
| mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 | |
Referências
- Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467 (1984).
- Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy. Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).
- Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta. Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).
- Requena, A. The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate. Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).
- Franciosi, F. In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes. Reprod Fertil Dev. , (2015).
- Franciosi, F. Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes. Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).
- Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology. , (2016).
- Hendriks, W. K. Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos. Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).
- Carnevale, E. M. The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).
- Ginther, O. J. The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women. Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs. Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).
- Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries. Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).
- Homer, H. A. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).
- Rambags, B. P. Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).
- Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity. J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).
- Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice. Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).
- Luzzo, K. M. High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects. PLoS One. 7 (11), e49217 (2012).
- Ma, P., Schultz, R. M. Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse. PLoS Genet. 9 (3), e1003377 (2013).
- Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).
- Luciano, A. M. Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B. Biol Reprod. 88 (3), 58 (2013).
- Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development. Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).
- Terzaghi, L. PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis. Cell Cycle. , 1-14 (2016).
- Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. Translation in the mammalian oocyte in space and time. Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).
- Chen, J. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).
- Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse. Biol Reprod. 88 (1), 11 (2013).
