Análise da segregação cromossômica, acetilação de histona e morfologia do fuso em ovócitos de cavalo

Summary

Este manuscrito descreve uma abordagem experimental para caracterizar morfologicamente e bioquimicamente ovócitos de cavalo. Especificamente, o presente trabalho ilustra como recolher ovócitos de equídeos imaturos e maduros por captação de óvulos guiados por ultra-som (OPU) e como investigar a segregação cromossómica, a morfologia do fuso, a acetilação das histonas globais ea expressão de mRNA.

Abstract

O campo da reprodução assistida tem sido desenvolvido para tratar a infertilidade em mulheres, animais de companhia e espécies ameaçadas. No cavalo, a reprodução assistida também permite a produção de embriões de alto desempenho sem interromper sua carreira esportiva e contribui para um aumento no número de potros de éguas de alto valor genético. O presente manuscrito descreve os procedimentos utilizados para a coleta de ovócitos imaturos e maduros de ovários de cavalo usando o coletor de óvulos (OPU). Estes oócitos foram então utilizados para investigar a incidência de aneuploidia através da adaptação de um protocolo previamente desenvolvido em ratinhos. Especificamente, os cromossomos e os centrómeros dos oócitos da metafase II (MII) foram marcados fluorescentemente e contados em planos focais sequenciais após varrimento de microscópio confocal a laser. Esta análise revelou uma incidência mais elevada na taxa de aneuploidia quando os oócitos imaturos foram recolhidos dos folículos e maturados in vitro em comparação comIn vivo. A imunocoloração para a tubulina ea forma acetilada da histona quatro em resíduos de lisina específicos também revelaram diferenças na morfologia do fuso meiótico e no padrão global de acetilação das histonas. Por fim, investigou-se a expressão de mRNAs que codificam histonas desacetilases (HDAC) e acetil-transferases (HATs) por transcrição reversa e PCR quantitativa (q-PCR). Não foram observadas diferenças na expressão relativa dos transcritos entre oócitos maturados in vitro e in vivo . De acordo com um silenciamento geral da actividade transcricional durante a maturação do oócito, a análise da quantidade total de transcrição só pode revelar estabilidade ou degradação do ARNm. Portanto, esses achados indicam que outras regulamentações de translação e pós-tradução podem ser afetadas.

Em geral, o presente estudo descreve uma abordagem experimental para caracterizar morfologicamente e bioquimicamente o oócito de cavalo, a ceTipo que é extremamente desafiador para estudar devido à baixa disponibilidade da amostra. No entanto, pode expandir nossos conhecimentos sobre a biologia reprodutiva e infertilidade em espécies monovulatórias.

Introduction

Uma vasta gama de técnicas de reprodução assistida foi desenvolvida para tratar a infertilidade em mulheres, animais de companhia e espécies ameaçadas de extinção. Um dos procedimentos mais comuns em contextos clínicos é a recuperação de oócitos da fase metafásica II (MII) dos folículos ovarianos por aspiração transvaginal guiada por ultrassom, captação de óvulos (OPU) ¹ . Estes oócitos são então fertilizados in vitro (FIV), com o (s) embrião (s) resultante (s) implantado (s) num útero receptor. Os oócitos do estádio MII (maduro) são recuperados após a administração de gonadotropinas exógenas. No entanto, este tratamento está associad....

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais CEEA Val de Loire Número 19 e foram realizados de acordo com os Princípios Orientadores para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Coleção de Oócitos e Maturação In Vitro

1. Recolha de óvulos
   1. Avaliar diariamente por ultra-som o diâmetro dos folículos ovarianos em uma coorte de éguas adultas. No surgimento de um folículo ≥ 33 mm (folículo dominante), injete a égua com 1.500 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG) na parte superior da veia jugular (iv).
      1. Antes de realizar a injeção, esfregue a área co....

Results

As descobertas originais destas experiências foram descritas em profundidade previamente ⁷ e são aqui relatadas como um exemplo de resultados que podem ser obtidos utilizando os protocolos descritos.

Taxa de maturação

Dos 32 COCs obtidos pela OPU dos folículos dominantes, 28 (88%) estavam na fase MII. Quatorze dos 58 COCs coletados de folículos .......

Discussion

Embora a IVM tenha sido realizada em cavalos há mais de 20 anos ¹⁶ , ainda não sabemos se o oócito pode ser a origem da aneuploidia embrionária, como tem sido proposto para os seres humanos ¹⁷ . A razão é provavelmente que a preparação de spreads de oócitos para contagem de cromossomos resulta em perda de amostra considerável. Com isto em mente, um levantamento dos métodos utilizados para investigar erros na segregação cromossômica foi conduzido para procurar a técnica mai.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
sonda de ultrassom	Aloka	UST-5820-7,5
centravet de gonadotrofina coriônica humana		CHO004	1.500 unidade/animal
IV centravet de detomidina		MED010	9 - 15 µ g/kg IV
butilescopolamina bromure	centravet	EST001	0,2 mg/kg IV
estereomicroscópio	NIKON	SMZ-2B
butorfanol	centravet	DOL003	10µ g/kg IV
benzil-penicilina	centravet	DEP203 IM	15.000 UI/animal
TCM199	Sigma-Aldrich	M3769 10X1L	pó para tamponado com hepes TCM199
Sal de sódio para hepes	Sigma-Aldrich	H3784-100G
albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A8806
heparina	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
NaHCO3-tamponado TCM199	Sigma-Aldrich	M2154-500ML	líquido para fator
crescimento epidérmico	Sigma-Aldrich	E4127
soro de bezerro recém-nascido	Sigma-Aldrich	N4762-500ML
pratos de 4 poços	NUNCLON
	Heraeus	BB6060
monastrol	Sigma-Aldrich	M8515
hialuronidase	Sigma-Aldrich	H3506
pronase	Sigma-Aldrich	P5147
paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148
álcool polivinílico	Sigma-Aldrich	341584
triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
soro de burro normal	Sigma-Aldrich	D9663
coelho anti-Aurora B fosfo-Thr232	BioLegend	636102
burro conjugado com TRITC anti-coelho IgG	Vector Laboratories	711-025-152
Vecta-Shield	Vector Laboratories	H-1000
YOPRO1	Thermofisher Microscópio	Scientific Y3603
	LSM 780	Zeiss
confocal de varredura a laser	LSM 700	Zeiss
ImageJ software	rsb.info. nih.gov/ij/download.html	recurso
mouse anti-alfa-tubulina	Sigma-Aldrich	T8203
coelho anti-acH4K16	Upstate Biotecnologia	07-329
AlexaFluor 488-coniugated burro anti-rato IgG	Life Technologies	A21202
4',6-diamidino-2-fenilindol	Sigma-Aldrich	D8417	Centrífuga DAPI
	Eppendorf	5417R
RNALater	Invitrogen	AM7020
Luciferase RNA	Promega	L4561
Kit de isolamento de RNA PicoPure	Applied Biosystems	12204-01
hexâmeros aleatórios	Thermofisher Scientific	N8080127
camundongo Moloney leucemia vírus transcriptase reversa	Thermofisher Scientific
SYBR supermix verde BioRad		1708880
primers específicos	Sigma-Aldrich		primers específicos foram projetados usando o software Primer3Plus (recurso gratuito)
termociclador	BioRad	MyiQ
camundongo monoclonal anti-CENPA	Abcam	ab13939
camundongo monoclonal anti-Aurora B	Abcam	ab3609