Analyse der Chromosomensegregation, Histonacetylierung und Spindelmorphologie in Pferdeozyten
Summary
Dieses Manuskript beschreibt einen experimentellen Ansatz zur morphologischen und biochemischen Charakterisierung von Pferdostozyten. Speziell veranschaulicht die vorliegende Arbeit, wie man unreife und reife Pferdoozyten durch Ultraschall-geführte Ovum-Pick-up (OPU) sammelt und wie man Chromosomensegregation, Spindelmorphologie, globale Histonacetylierung und mRNA-Expression untersucht.
Abstract
Das Feld der assistierten Reproduktion wurde entwickelt, um Unfruchtbarkeit bei Frauen, Begleittieren und gefährdeten Arten zu behandeln. Im Pferd erlaubt die assistierte Reproduktion auch die Produktion von Embryonen von Hochleistungskünstlern, ohne ihre sportliche Karriere zu unterbrechen und trägt zu einer Zunahme der Anzahl von Fohlen aus Stuten mit hohem genetischen Wert bei. Das vorliegende Manuskript beschreibt die Verfahren, die zum Sammeln von unreifen und reifen Oozyten aus Pferd Eierstöcken mit Ovum Pick-up (OPU) verwendet werden. Diese Oozyten wurden dann verwendet, um die Inzidenz von Aneuploidie durch die Anpassung eines Protokolls, das zuvor in Mäusen entwickelt wurde, zu untersuchen. Speziell wurden die Chromosomen und die Zentromere der Metaphase-II (MII) -Oozyten fluoreszenzmarkiert und auf sequentielle Fokuspläne nach konfokaler Lasermikroskop-Scanning gezählt. Diese Analyse zeigte eine höhere Inzidenz in der Aneuploidie-Rate, wenn unreife Oozyten aus den Follikeln gesammelt und in vitro im Vergleich zu reifenIn vivo Immunfärbung für Tubulin und die acetylierte Form von Histon vier an spezifischen Lysinresten zeigten auch Unterschiede in der Morphologie der meiotischen Spindel und im globalen Muster der Histonacetylierung. Schließlich wurde die Expression von mRNAs, die für Histon-Deacetylasen (HDACs) und Acetyl-Transferasen (HATs) kodieren, durch reverse Transkription und quantitative-PCR (q-PCR) untersucht. Es wurden keine Unterschiede in der relativen Expression von Transkripten zwischen in vitro und in vivo reifen Oozyten beobachtet. In Übereinstimmung mit einem allgemeinen Stummschalten der Transkriptionsaktivität während der Oozytenreifung kann die Analyse der Gesamttranskriptmenge nur die mRNA-Stabilität oder den Abbau zeigen. Daher deuten diese Befunde darauf hin, dass andere translatorische und posttranslationale Regelungen betroffen sein könnten.
Insgesamt beschreibt die vorliegende Studie einen experimentellen Ansatz zur morphologischen und biochemischen Charakterisierung der PferdeozytenLl Typ, das ist extrem schwierig zu studieren aufgrund der geringen Probenverfügbarkeit. Allerdings kann es unser Wissen über die Fortpflanzungsbiologie und Unfruchtbarkeit in monovulatorischen Spezies erweitern.
Introduction
Eine breite Palette von assistierten Reproduktionstechniken wurde entwickelt, um Unfruchtbarkeit bei Frauen, Begleittieren und gefährdeten Arten zu behandeln. Eine der häufigsten Verfahren in der klinischen Umgebung ist die Abfrage von Metaphase II (MII) -Stufen-Oozyten aus den Ovarialfollikeln durch Ultraschall-geführte transvaginale Aspiration, Eizelle (OPU) 1 . Diese Oozyten werden dann in vitro (IVF) befruchtet, wobei der resultierende Embryo (s) in einen Empfänger-Uterus implantiert wird. Die MII-Stadium (reifen) Oozyten werden nach der Verabreichung von exogenen Gonadotropinen gewonnen. Allerdings ist diese Behandlung bei einigen Patienten mit der Entwicklung des Ovarialhyperstimulationssyndroms (OHSS) 2 assoziiert.
Wenn man die intrinsische Fähigkeit von ausgewachsenen, unreifen Oozyten (GV-Stadium) ausnutzt, um die Meiose nach der Isolierung aus ihren Follikeln spontan wieder aufzunehmen, ist es möglich, reife Oozyten ohne Adminis zu erhaltenGonadotropin 3 . Dieses Verfahren wird als Oozyten- In-vitro- Reifung (IVM) bezeichnet und stellt einen weniger drogenorientierten, weniger teuren und patientenfreundlichen Ansatz für die assistierte Reproduktionstechnologie dar. Allerdings ist der Erfolg der Embryo-Entwicklung mit in vitro- reifen Oozyten im Allgemeinen niedriger als bei in vivo gereiften Oozyten 4 , 5 . Eine mögliche Erklärung ist, dass in vitro gereifte Oozyten stärker von Fehlern in der Chromosomensegregation betroffen sind und die resultierende Aneuploidie die normale embryonale Entwicklung beeinträchtigt 6 .
Das Verständnis der molekularen Basis der chromosomalen Fehlsegregation während IVM würde letztlich das volle Potential dieser Technik offenlegen. In diesem Sinne wurde der experimentelle Ansatz verwendet, um die morphologischen und biochemischen Merkmale von in vitro- reifen Oozyten im Vergleich zu in vivo matur zu untersuchenEd Oozyten ist hier beschrieben 7 , 8 . Insbesondere werden die Verfahren für die OPU von unreifen und reifen Oozyten und die IVM von unreifen Oozyten unter Verwendung von erwachsenen und natürlich-radierenden Pferden als experimentelles Modell veranschaulicht. Dann werden Immunfluoreszenz und Bildanalyse verwendet, um die Chromosomensegregation, die Spindelmorphologie und das globale Muster der Histonacetylierung auf diesen Gameten zu untersuchen. Schließlich wird für die Analyse der mRNA-Expression ein Protokoll der Reverse-Transkription und der quantitativen PCR beschrieben.
Im Vergleich zu Nagetier-Tiermodellen erlauben Pferde keine genetische Manipulation, sind weniger leicht zu manipulieren und erfordern teure Wartung. Allerdings gewinnt dieses Modell ein beträchtliches Interesse für die Untersuchung der Oozytenreifung 9 , 10 aufgrund der Ähnlichkeit mit der menschlichen Eierstockphysiologie 11 , 12 </ Sup>. Darüber hinaus hat die Entwicklung von zuverlässigen Protokollen von IVM-IVF im Pferd ein erhebliches wirtschaftliches Interesse, da es eine Erhöhung der Anzahl der Fohlen von Stuten mit hohem genetischen Wert ermöglichen würde.
Eine der Einschränkungen der Durchführung von Experimenten an Oozyten, insbesondere bei monovulatorischen Spezies, ist die eingeschränkte Probenverfügbarkeit. Diese Grenze wurde hier durch die Anpassung eines bisher in Mäusen entwickelten Ansatzes an die Pferdeozyten 13 , 14 überwunden, um eine Chromosomenzählung durchzuführen, die den Probenverlust minimiert (siehe die Diskussion um einen Vergleich mit anderen verfügbaren Techniken). Darüber hinaus wurde ein Triple-Fluoreszenz-Färbeprotokoll optimiert, um mehrere Analysen auf der gleichen Probe durchzuführen, und q-PCR-Analysen wurden nur an Pools von 2 Oozyten durchgeführt.
Insgesamt beschreibt die vorliegende Studie einen experimentellen Ansatz, der auf morphologisch und biochemisch beschränkt istRacterize die Pferd-Oozyte, ein Zell-Typ, der extrem schwierig zu studieren ist aufgrund der geringen Probenverfügbarkeit. Allerdings kann es unser Wissen über die Fortpflanzungsbiologie und die Unfruchtbarkeit von monovulatorischen Spezies erweitern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl IVM seit mehr als 20 Jahren bei Pferden aufgeführt ist, wissen wir noch nicht, ob die Oozyte der Ursprung der embryonalen Aneuploidie sein kann, wie es für den Menschen vorgeschlagen wurde. Der Grund dafür ist wahrscheinlich, dass die Vorbereitung der Oozytenaufstriche für die Chromosomenzählung zu einem erheblichen Probenverlust führt. In diesem Sinne wurde eine Übersicht über die Methoden, die für die Untersuchung von Fehlern in der Chromosomensegregation verwendet wurden, durchgeführt, um nach der am…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Fabrice Vincent für die Unterstützung bei der Laserscanning-konfokalen Mikroskopie (LSCM) und Philippe Barrière und Thierry Blard für die tägliche Ultraschall-Ovarial-Scanning und hCG-Injektion. Diese Arbeit wurde teilweise durch das Projekt "Regione Sardegna und Regione Lombardia" "Ex Ovo Omnia" (Zuschuss Nr. 26096200 an AML) unterstützt; Die "L'Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012" Stipendium (Vertrag 2012 bis FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, Forschungsausschuss (REA) "Pro-Ovum" (Zuschuss Nr. 303640 bis VL); Und durch die vom Europäischen Sozialfonds kofinanzierte Postdoktorandenschule für Landwirtschaft und Veterinärmedizin, Sektorielles operationelles Programm für die Entwicklung der Humanressourcen 2007-2013 (Vertrag Nr. POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 bis IM). Die In-vivo- Oozyten-Sammlung wurde vom Institut Français du Cheval et de l'Equitation finanziert.
Materials
| ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
| human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
| detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
| butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
| stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
| butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
| benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
| TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
| Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
| 4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
| incubator | Heraeus | BB6060 | |
| monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
| TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
| Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
| ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
| mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
| rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
| AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
| Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
| mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
| SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
| specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
| thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
| mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
| mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 | |
Referências
- Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467 (1984).
- Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy. Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).
- Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta. Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).
- Requena, A. The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate. Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).
- Franciosi, F. In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes. Reprod Fertil Dev. , (2015).
- Franciosi, F. Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes. Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).
- Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology. , (2016).
- Hendriks, W. K. Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos. Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).
- Carnevale, E. M. The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).
- Ginther, O. J. The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women. Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs. Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).
- Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries. Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).
- Homer, H. A. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).
- Rambags, B. P. Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).
- Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity. J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).
- Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice. Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).
- Luzzo, K. M. High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects. PLoS One. 7 (11), e49217 (2012).
- Ma, P., Schultz, R. M. Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse. PLoS Genet. 9 (3), e1003377 (2013).
- Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).
- Luciano, A. M. Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B. Biol Reprod. 88 (3), 58 (2013).
- Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development. Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).
- Terzaghi, L. PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis. Cell Cycle. , 1-14 (2016).
- Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. Translation in the mammalian oocyte in space and time. Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).
- Chen, J. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).
- Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse. Biol Reprod. 88 (1), 11 (2013).
