Analisi della segregazione dei cromosomi, acetilazione istonica e morfologia del mandrino nei cavalli ovociti
Summary
Questo manoscritto descrive un approccio sperimentale per caratterizzare morfologicamente e biochimicamente i ovociti dei cavalli. In particolare, il presente lavoro illustra come raccogliere oociti di cavalli immaturi e maturi mediante raccolta di ovuli guidati da ultrasuoni (OPU) e come indagare la segregazione del cromosoma, la morfologia del mandrino, l'acetilazione degli istoni globali e l'espressione di mRNA.
Abstract
Il campo della riproduzione assistita è stato sviluppato per trattare l'infertilità in donne, animali da compagnia e specie in pericolo. Nel cavallo, la riproduzione assistita consente anche la produzione di embrioni da parte di artisti di alto livello senza interrompere la loro carriera sportiva e contribuisce ad aumentare il numero di puledri provenienti da greggi di alto valore genetico. Il presente manoscritto descrive le procedure utilizzate per la raccolta di ovociti immature e mature da ovari a cavallo mediante prelevamento di ovuli (OPU). Questi oociti sono stati poi usati per indagare l'incidenza di aneuploidy adattando un protocollo precedentemente sviluppato nei topi. In particolare, i cromosomi ei centrometi di oociti metafase II (MII) sono stati etichettati in fluorescenza e contati su piani focali sequenziali dopo la scansione a microscopio laser confocale. Questa analisi ha rivelato una maggiore incidenza nel tasso di aneuploidy quando ovociti immature sono stati raccolti dai follicoli e maturati in vitro rispetto aIn vivo. Immunostaining per tubulin e la forma acetilata di istone 4 a residui di lisina specifici hanno anche rivelato differenze nella morfologia del mandrino meiotico e nel modello globale di acetilazione istone. Infine, l'espressione di mRNA che codificano le deacetilasi dell'istone (HDACs) e acetil-transferasi (HAT) è stata studiata mediante trascrizione inversa e PCR quantitativa (q-PCR). Nessuna differenza nell'espressione relativa dei trascritti è stata osservata tra ovociti maturi in vitro e in vivo . In accordo con un silenziamento generale dell'attività trascrizionale durante la maturazione di oociti, l'analisi della quantità totale di trascritti può rivelare solo la stabilità o la degradazione della mRNA. Pertanto, questi risultati indicano che potrebbero essere interessate altre normative traslazionali e post-traduzionali.
Nel complesso, il presente studio descrive un approccio sperimentale che caratterizza morfologicamente e biochimicamente l'ovocita dei cavalli, una ceLl tipo che è estremamente impegnativo da studiare a causa della scarsa disponibilità di campioni. Tuttavia, può espandere le nostre conoscenze sulla biologia riproduttiva e sulla sterilità in specie monovulatorie.
Introduction
Una vasta gamma di tecniche di riproduzione assistita è stata sviluppata per trattare l'infertilità in donne, animali da compagnia e specie in pericolo. Una delle procedure più comuni nelle impostazioni cliniche è il recupero di oociti di fase metafase II (MII) dai follicoli ovarici mediante aspirazione transvaginale guidata da ultrasuoni, prelevamento ovulo (OPU) 1 . Questi oociti vengono poi fecondati in vitro (IVF), con gli embrioni risultanti impiantati in un utero ricevente. Gli oociti di fase MII (maturi) vengono recuperati a seguito della somministrazione di gonadotropine esogene. Tuttavia, questo trattamento è associato, in alcuni pazienti, allo sviluppo di sindrome da iperstimolazione ovarica (OHSS) 2 .
Sfruttando la capacità intrinseca di ovociti immature (GV-stage) completamente coltivati a riprendere spontaneamente la meiosi una volta isolata dai loro follicoli, è possibile ottenere oociti maturi senza somministrazioneGonadotropina 3 . Questa procedura è chiamata oocyte in vitro maturazione (IVM) e rappresenta un approccio meno drogato, meno costoso e più paziente per la tecnologia riproduttiva assistita. Tuttavia, il successo dello sviluppo degli embrioni con ovociti in vitro è generalmente inferiore a quello con oociti maturi in vivo 4 , 5 . Una possibile spiegazione è che gli ovociti maturi in vitro sono maggiormente colpiti da errori nella segregazione del cromosoma e l'aneuploidy risultante compromette lo sviluppo embrionale normale 6 .
La comprensione della base molecolare della mis-segregazione cromosomica durante l'IVM potrebbe infine fornire il pieno potenziale di questa tecnica. In questo senso, l'approccio sperimentale utilizzato per indagare le caratteristiche morfologiche e biochimiche degli oociti in vitro, confrontati con la maturazione in vivoEd oociti qui descritti sono 7 , 8 . In particolare, le procedure per l'OPU di ovociti immature e mature e l'IVM di ovociti immature sono illustrati utilizzando cavalli adulti e ciclisti naturalmente come modello sperimentale. Allora, l'immunofluorescenza e l'analisi delle immagini vengono utilizzati per studiare la segregazione del cromosoma, la morfologia del mandrino e il modello globale dell'acetilazione dell'istone su questi gameti. Infine, un protocollo di trascrizione inversa e PCR quantitativo è descritto per l'analisi dell'espressione mRNA.
Rispetto ai modelli animali roditori, i cavalli non consentono manipolazione genetica, sono meno facili da manipolare e richiedono una costosa manutenzione. Tuttavia, questo modello sta guadagnando un notevole interesse per lo studio della maturazione delle ovaie 9 , 10 a causa della somiglianza con la fisiologia ovarica umana 11 , 12 </ Sup>. Inoltre, lo sviluppo di protocolli affidabili di IVM-IVF nel cavallo ha un notevole interesse economico, in quanto consentirebbe un aumento del numero di puledri da greggi di alto valore genetico.
Una delle limitazioni di effettuare esperimenti su oociti, in particolare nelle specie monovulatorie, è la disponibilità limitata del campione. Questo limite è stato superato qui regolando un approccio, precedentemente sviluppato nei topi, a oociti di cavalli 13 , 14 per effettuare il conteggio dei cromosomi che minimizza la perdita di campioni (vedere la discussione per un confronto con altre tecniche disponibili). Inoltre, è stato ottimizzato un protocollo di colorazione a triplo fluorescenza per condurre analisi multiple sullo stesso campione e le analisi q-PCR sono state eseguite solo su piscine di 2 oociti.
Nel complesso, il presente studio descrive un approccio sperimentale mirato a morfologicamente e biochimicamente chaRacterize l'oocyte di cavallo, un tipo di cellule che è estremamente impegnativo da studiare a causa della bassa disponibilità del campione. Tuttavia, può espandere la nostra conoscenza della biologia riproduttiva e della sterilità delle specie monovulatorie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se l'IVM è stato eseguito in cavalli per più di 20 anni 16 , non sappiamo ancora se l'oocyte possa essere l'origine dell'aneuploidy embrionale, come è stato proposto per l'uomo17. La ragione è probabilmente che la preparazione di spread di oociti per il conteggio dei cromosomi comporta una notevole perdita di campioni. Tenuto conto di questo, è stata condotta un'indagine sui metodi utilizzati per indagare gli errori nella segregazione dei cromosomi per cercare l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero ringraziare Fabrice Vincent per il supporto con la microscopia confocale a scansione laser (LSCM) e Philippe Barrière e Thierry Blard per eseguire la scansione giornaliera di ovaie e hCG. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal progetto "Regione di Sardegna e Regione Lombardia" "Ex Ovo Omnia" (n. 26096200 a AML); La borsa di studio "L'Oreal Italia per la Donne e la Scienza 2012" (contratto 2012 a FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, Agenzia esecutiva di ricerca (REA) "Pro-Ovum" (Grant n ° 303640 a VL); E dalla Scuola post-dottorata di agricoltura e veterinaria, cofinanziata dal Fondo sociale europeo, Programma operativo settoriale per lo sviluppo delle risorse umane 2007-2013 (n. POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 a IM). La raccolta inoculare in vivo è stata finanziata dall'Institut Français du Cheval et de l'Equitation.
Materials
| ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
| human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
| detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
| butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
| stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
| butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
| benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
| TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
| Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
| 4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
| incubator | Heraeus | BB6060 | |
| monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
| TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
| Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
| ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
| mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
| rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
| AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
| Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
| mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
| SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
| specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
| thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
| mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
| mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 | |
Referências
- Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467 (1984).
- Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy. Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).
- Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta. Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).
- Requena, A. The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate. Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).
- Franciosi, F. In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes. Reprod Fertil Dev. , (2015).
- Franciosi, F. Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes. Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).
- Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology. , (2016).
- Hendriks, W. K. Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos. Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).
- Carnevale, E. M. The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).
- Ginther, O. J. The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women. Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs. Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).
- Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries. Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).
- Homer, H. A. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).
- Rambags, B. P. Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).
- Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity. J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).
- Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice. Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).
- Luzzo, K. M. High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects. PLoS One. 7 (11), e49217 (2012).
- Ma, P., Schultz, R. M. Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse. PLoS Genet. 9 (3), e1003377 (2013).
- Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).
- Luciano, A. M. Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B. Biol Reprod. 88 (3), 58 (2013).
- Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development. Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).
- Terzaghi, L. PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis. Cell Cycle. , 1-14 (2016).
- Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. Translation in the mammalian oocyte in space and time. Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).
- Chen, J. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).
- Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse. Biol Reprod. 88 (1), 11 (2013).
