Анализ сегрегации хромосом, ацетилирование гистонов и морфология веретена в ооцитах лошадей
Summary
Эта рукопись описывает экспериментальный подход к морфологическим и биохимическим характеристикам ооцитов лошадей. В частности, в настоящей работе показано, как собирать незрелые и зрелые ооциты лошади с помощью ультразвукового наводящего пипетки (OPU) и как исследовать сегрегацию хромосом, морфологию веретена, глобальное ацетилирование гистонов и экспрессию мРНК.
Abstract
Область вспомогательного размножения была разработана для лечения бесплодия у женщин, домашних животных и исчезающих видов. У лошадей вспомогательное воспроизведение также позволяет производить эмбрионы от высоких исполнителей без прерывания их спортивной карьеры и способствует увеличению числа жеребят у кобыл высокой генетической ценности. Настоящая рукопись описывает процедуры, используемые для сбора незрелых и зрелых ооцитов из яичников лошадей с использованием пипетки яйцеклеток (OPU). Эти ооциты затем использовали для исследования частоты анеуплоидии путем адаптации протокола, ранее разработанного на мышах. В частности, хромосомы и центромеры ооцитов метафазы II (MII) флуоресцентно маркировали и подсчитывали на последовательные фокальные планы после сканирования конфокального лазерного микроскопа. Этот анализ выявил более высокую частоту анеуплоидии, когда незрелые ооциты были собраны из фолликулов и созревали in vitro по сравнению сIn vivo. Иммунное окрашивание тубулина и ацетилированная форма гистона-4 в определенных остатках лизина также выявило различия в морфологии мейотического веретена и в глобальной структуре ацетилирования гистонов. Наконец, экспрессия мРНК, кодирующих гистондеацетилазы (HDACs) и ацетилтрансфераз (HATs), исследовалась с помощью обратной транскрипции и количественной ПЦР (q-ПЦР). Отличия в относительной экспрессии транскриптов не наблюдались между созревшими in vitro и ооцитами de vivo . В соответствии с общим молчанием транскрипционной активности во время созревания ооцитов анализ суммарного количества транскриптов может выявить только стабильность или деградацию мРНК. Таким образом, эти выводы показывают, что могут быть затронуты другие правила перевода и посттрансляции.
В целом, настоящее исследование описывает экспериментальный подход к морфологическим и биохимическим характеристикам ооцита лошади,Типа, который чрезвычайно сложно изучить из-за низкой доступности образцов. Тем не менее, он может расширить наши знания о репродуктивной биологии и бесплодии у моновируляционных видов.
Introduction
Для лечения бесплодия у женщин, животных-компаньонов и исчезающих видов разработано множество методов вспомогательной репродукции. Одной из наиболее распространенных процедур в клинических условиях является извлечение ооцитов из метафазы II (MII) из фолликулов яичников с помощью ультразвуковой трансвагинальной аспирации, пикап яичника (OPU) 1 . Эти ооциты затем оплодотворяются in vitro (IVF), с полученным эмбрионом (ами), имплантированным в матку-реципиенту. MII-стадии (зрелые) ооциты извлекаются после введения экзогенных гонадотропинов. Однако это лечение ассоциируется у некоторых пациентов с развитием синдрома гиперстимуляции яичников (OHSS) 2 .
Пользуясь внутренней способностью полностью выращенных незрелых ооцитов (GV-стадия) спонтанно возобновлять мейоз после выделения из их фолликулов, можно получить зрелые ооциты без введенияГонадотропин 3 . Эта процедура называется созреванием ооцита in vitro (IVM) и представляет собой менее ориентированный на наркотики, менее дорогой и более дружелюбный к пациенту подход к вспомогательным репродуктивным технологиям. Однако успех развития эмбрионов с ооцитами, выращенными in vitro, как правило, ниже, чем у ооцитов созревших in vivo 4 , 5 . Возможное объяснение состоит в том, что созревающие in vitro ооциты в большей степени подвержены ошибкам в сегрегации хромосом, а возникающая анеуплоидия нарушает нормальное эмбриональное развитие 6 .
Понимание молекулярной основы хромосомной неправильной сегрегации во время IVM в конечном счете раскрыло бы полный потенциал этого метода. В этом ключе экспериментальный подход, используемый для исследования морфологических и биохимических особенностей in vitro -зрелых ооцитов, по сравнению с in vivo maturОоциты описаны здесь 7 , 8 . В частности, процедуры OPU незрелых и зрелых ооцитов и IVM незрелых ооцитов иллюстрируются с использованием взрослых лошадей и лошадей с естественной едой в качестве экспериментальной модели. Затем проводят иммунофлюоресценцию и анализ изображения, чтобы исследовать сегрегацию хромосом, морфологию веретена и глобальную картину ацетилирования гистонов на этих гаметах. Наконец, описан протокол обратной транскрипции и количественной ПЦР для анализа экспрессии мРНК.
По сравнению с моделями животных-грызунов лошади не допускают генетических манипуляций, их труднее манипулировать и требуют дорогого ухода. Однако эта модель приобретает значительный интерес для изучения созревания ооцитов 9 , 10 из-за сходства с физиологией яичников у людей 11 , 12 </ SUP>. Более того, разработка надежных протоколов IVM-IVF у лошади имеет существенный экономический интерес, так как это позволило бы увеличить число жеребят у кобыл высокой генетической ценности.
Одним из ограничений проведения экспериментов на ооцитах, особенно в моновируляционных видах, является ограниченная доступность образцов. Этот предел был преодолен путем корректировки подхода, ранее разработанного на мышах, к ооцитам лошадей 13 , 14 , чтобы проводить подсчет хромосом, который минимизирует потерю образца (см. Обсуждение для сравнения с другими доступными методами). Кроме того, протокол трифлуоресцентного окрашивания был оптимизирован для проведения множественных анализов в одном образце, а q-PCR-анализ проводился только для пулов с 2 ооцитами.
В целом, настоящее исследование описывает экспериментальный подход, направленный на морфологически и биохимически чаРактеризировать ооцит лошади, тип клетки, который чрезвычайно сложно изучить из-за низкой доступности образцов. Тем не менее, он может расширить наши знания о репродуктивной биологии и бесплодии моновируляционных видов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несмотря на то, что IVM был проведен на лошадях более 20 лет 16 , мы еще не знаем, может ли ооцит быть источником эмбриональной анеуплоидии, как это было предложено для людей 17 . Причина, вероятно, в том, что приготовление спредов ооцитов для подсчета хромосом приводи…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Фабриса Винсента за поддержку лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM) , а также Филиппа Барьера и Тьерри Бларда за ежедневное ультразвуковое сканирование яичников и инъекцию ХГЧ. Эта работа была частично поддержана проектом "Regione Sardegna and Regione Lombardia" "Ex Ovo Omnia" (Грант № 26096200 по борьбе с отмыванием денег); «Стипендия L'Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012» (контракт от 2012 года до FF), FP7-PEOPLE-2011-CIG, Исполнительное агентство по исследованиям (REA) «Pro-Ovum» (грант № 303640 по VL); И Постдокторской школой земледелия и ветеринарной медицины, финансируемой совместно с Европейским социальным фондом, Секторальная оперативная программа развития людских ресурсов на 2007-2013 годы (контракт № POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 для IM). Сбор яйцеклеток in vivo финансировался Институтом французского языка им. Шеваля и Эквивалента.
Materials
| ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
| human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
| detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
| butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
| stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
| butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
| benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
| TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
| Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
| 4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
| incubator | Heraeus | BB6060 | |
| monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
| TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
| Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
| ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
| mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
| rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
| AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
| Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
| mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
| SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
| specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
| thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
| mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
| mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 | |
Referências
- Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467 (1984).
- Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy. Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).
- Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta. Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).
- Requena, A. The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate. Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).
- Franciosi, F. In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes. Reprod Fertil Dev. , (2015).
- Franciosi, F. Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes. Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).
- Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology. , (2016).
- Hendriks, W. K. Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos. Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).
- Carnevale, E. M. The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).
- Ginther, O. J. The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women. Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs. Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).
- Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries. Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).
- Homer, H. A. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).
- Rambags, B. P. Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).
- Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity. J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).
- Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice. Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).
- Luzzo, K. M. High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects. PLoS One. 7 (11), e49217 (2012).
- Ma, P., Schultz, R. M. Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse. PLoS Genet. 9 (3), e1003377 (2013).
- Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).
- Luciano, A. M. Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B. Biol Reprod. 88 (3), 58 (2013).
- Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development. Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).
- Terzaghi, L. PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis. Cell Cycle. , 1-14 (2016).
- Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. Translation in the mammalian oocyte in space and time. Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).
- Chen, J. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).
- Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse. Biol Reprod. 88 (1), 11 (2013).
