Análisis de la segregación cromosómica, acetilación de histonas y morfología de huso en ovocitos de caballo
Summary
Este manuscrito describe un enfoque experimental para caracterizar morfológicamente y bioquímicamente ovocitos de caballo. Específicamente, el presente trabajo ilustra cómo recolectar ovocitos de caballo inmaduros y maduros mediante recogida de óvulos guiada por ultrasonido (OPU) y cómo investigar la segregación de cromosomas, morfología de huso, acetilación de histonas globales y expresión de mRNA.
Abstract
El campo de la reproducción asistida se ha desarrollado para tratar la infertilidad en mujeres, animales de compañía y especies amenazadas. En el caballo, la reproducción asistida también permite la producción de embriones de alto rendimiento sin interrumpir su carrera deportiva y contribuye a un aumento en el número de potros de yeguas de alto valor genético. El presente manuscrito describe los procedimientos utilizados para recolectar ovocitos inmaduros y maduros de ovarios de caballo utilizando la recolección de óvulos (OPU). Estos ovocitos se utilizaron entonces para investigar la incidencia de aneuploidia mediante la adaptación de un protocolo previamente desarrollado en ratones. Específicamente, los cromosomas y los centrómeros de los ovocitos de la metafase II (MII) se marcaron fluorescentemente y se contaron en planos focales secuenciales después de un escaneado con microscopio láser confocal. Este análisis reveló una mayor incidencia en la tasa de aneuploidía cuando ovocitos inmaduros fueron recogidos de los folículos y madurado in vitro en comparación conIn vivo. La inmunotinción para la tubulina y la forma acetilada de la histona cuatro en residuos de lisina específicos también reveló diferencias en la morfología del huso meiótico y en el patrón global de acetilación de las histonas. Por último, la expresión de mRNAs que codifican histonas deacetilasas (HDAC) y acetil-transferasas (HATs) se investigó mediante transcripción inversa y PCR cuantitativa (q-PCR). No se observaron diferencias en la expresión relativa de los transcritos entre ovocitos madurados in vitro e in vivo . De acuerdo con un silenciamiento general de la actividad transcripcional durante la maduración de ovocitos, el análisis de la cantidad total de transcripción sólo puede revelar la estabilidad del ARNm o la degradación. Por lo tanto, estos hallazgos indican que otras regulaciones traslacionales y postraduccionales podrían verse afectadas.
En general, el presente estudio describe un enfoque experimental para caracterizar morfológicamente y bioquímicamente el ovocito de caballo, ceLl tipo que es extremadamente difícil de estudiar debido a la baja disponibilidad de la muestra. Sin embargo, puede ampliar nuestro conocimiento sobre la biología reproductiva y la infertilidad en las especies monovulatorias.
Introduction
Se ha desarrollado una amplia gama de técnicas de reproducción asistida para tratar la infertilidad en mujeres, animales de compañía y especies en peligro de extinción. Uno de los procedimientos más comunes en los contextos clínicos es la recuperación de ovocitos de la fase metafásica II (MII) de los folículos ováricos por aspiración transvaginal guiada por ultrasonido, recolección de óvulos (OPU) 1 . Estos ovocitos son entonces fertilizados in vitro (FIV), con el (los) embrión (es) resultante (s) implantado (s) en un útero receptor. Los ovocitos de fase MII (maduros) se recuperan después de la administración de gonadotropinas exógenas. Sin embargo, este tratamiento se asocia, en algunos pacientes, con el desarrollo del síndrome de hiperestimulación ovárica (SHO) 2 .
Aprovechando la capacidad intrínseca de los ovocitos inmaduros (GV-etapa) para reanudar espontáneamente la meiosis una vez aislado de sus folículos, es posible obtener ovocitos maduros sin adminisLa gonadotropina 3 . Este procedimiento se denomina maduración in vitro de ovocitos (IVM) y representa un enfoque menos orientado a fármacos, menos costoso y más amigable con el paciente a la tecnología de reproducción asistida. Sin embargo, el éxito del desarrollo embrionario con ovocitos madurados in vitro es generalmente menor que con los ovocitos madurados in vivo 4 , 5 . Una posible explicación es que ovocitos madurados in vitro son más afectados por errores en la segregación cromosómica, y la aneuploidía resultante impide el desarrollo embrionario normal [ 6] .
Entender las bases moleculares de la segregación cromosómica errónea durante la IVM revelaría en última instancia todo el potencial de esta técnica. En este sentido, el enfoque experimental utilizado para investigar las características morfológicas y bioquímicas de los ovocitos madurados in vitro , pt comparación con la madurez in vivoEd oocitos se describe aquí 7 , 8 . Específicamente, los procedimientos para la OPU de ovocitos inmaduros y maduros y la IVM de ovocitos inmaduros se ilustran utilizando caballos adultos y de ciclo natural como modelo experimental. Luego, la inmunofluorescencia y el análisis de imágenes se utilizan para investigar la segregación cromosómica, la morfología del huso, y el patrón global de acetilación de histonas en estos gametos. Finalmente, se describe un protocolo de transcripción inversa y PCR cuantitativa para el análisis de la expresión de mRNA.
En comparación con los modelos animales de roedores, los caballos no permiten la manipulación genética, son menos fáciles de manipular y requieren un mantenimiento costoso. Sin embargo, este modelo está ganando interés considerable para el estudio de la maduración de ovocitos 9 , 10 debido a la similitud con la fisiología ovárica humana 11 , 12 </ Sup>. Por otra parte, el desarrollo de protocolos fiables de IVM-IVF en el caballo tiene un interés económico sustancial, ya que permitiría un aumento en el número de potros de yeguas de alto valor genético.
Una de las limitaciones de realizar experimentos en ovocitos, especialmente en especies monovulatorias, es la disponibilidad restringida de muestras. Este límite se ha superado aquí ajustando un enfoque, previamente desarrollado en ratones, a ovocitos de caballo 13 , 14 con el fin de llevar a cabo el recuento de cromosomas que minimiza la pérdida de muestra (véase la discusión para una comparación con otras técnicas disponibles). Además, se ha optimizado un protocolo de tinción con fluorescencia triple para realizar múltiples análisis en la misma muestra, y se realizaron análisis de q-PCR en agrupaciones de 2 oocitos solamente.
En general, el presente estudio describe un enfoque experimental dirigido a morfológicamente y bioquímicamente chaRacterizar el ovocito del caballo, un tipo de célula que es extremadamente difícil de estudiar debido a la baja disponibilidad de la muestra. Sin embargo, puede ampliar nuestro conocimiento de la biología reproductiva y la infertilidad de las especies monovulatorias.
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesar de que la IVM se ha realizado en caballos durante más de 20 años 16 , todavía no sabemos si el ovocito puede ser el origen de la aneuploidía embrionaria, como se ha propuesto para los seres humanos [ 17] . La razón es, probablemente, que la preparación de los diferenciales de oocitos para el conteo de cromosomas da lugar a una pérdida considerable de muestras. Con esto en mente, una encuesta de los métodos utilizados para investigar errores en la segregaci?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Fabrice Vincent por el soporte con microscopía confocal de barrido láser (LSCM) , y Philippe Barrière y Thierry Blard por realizar el ultrasonido de exploración ovárica diaria y la inyección de hCG. Este trabajo fue apoyado en parte por el proyecto "Regione Sardegna y Regione Lombardia" "Ex Ovo Omnia" (Subvención 26096200 a AML); La beca "L'Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012" (Contrato 2012 a FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, Agencia Ejecutiva de Investigación (REA) "Pro-Ovum" (Subvención 303640 a VL); Y por la Escuela Postdoctoral de Agricultura y Medicina Veterinaria, cofinanciada por el Fondo Social Europeo, Programa Operativo Sectorial para el Desarrollo de los Recursos Humanos 2007-2013 (Contrato POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 a IM). La colección de ovocitos in vivo fue financiada por el Institut Français du Cheval et de l'Equitation.
Materials
| ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
| human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
| detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
| butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
| stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
| butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
| benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
| TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
| Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
| 4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
| incubator | Heraeus | BB6060 | |
| monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
| TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
| Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
| ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
| mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
| rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
| AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
| Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
| mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
| SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
| specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
| thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
| mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
| mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 | |
Referências
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