Analys av kromosomsegregation, histonacetylering och spindelmorfologi i hästocyter
Summary
Detta manuskript beskriver ett experimentellt tillvägagångssätt för att morfologiskt och biokemiskt karakterisera hästocyter. Specifikt illustrerar föreliggande arbete hur man samlar omogena och mogna hästocyter genom ultraljudstyrd äggupphämtning (OPU) och hur man undersöker kromosomsegregation, spindelmorfologi, global histonacetylering och mRNA-uttryck.
Abstract
Fältet assisterad reproduktion har utvecklats för att behandla infertilitet hos kvinnor, följeslagare och hotade arter. I hästen tillåter assisterad reproduktion också framställning av embryon från högpresterande utan att avbryta sin idrottskarriär och bidrar till en ökning av antalet föl från marer av högt genetiskt värde. Det nuvarande manuskriptet beskriver de förfaranden som används för att samla omogna och mogna oocyter från hästjuvarier med hjälp av äggplockning (OPU). Dessa oocyter användes sedan för att undersöka förekomsten av aneuploidi genom att anpassa ett protokoll som tidigare utvecklats i möss. Speciellt märktes kromosomerna och centromererna av metafas II (MII) -ocyter fluorescens och räknades på sekventiella fokalplaner efter konfokal lasermikroskopskanning. Denna analys avslöjade en högre incidens i aneuploiditetsfrekvensen när omogna oocyter uppsamlades från folliklarna och mognades in vitro jämfört medIn vivo. Immunostaining för tubulin och den acetylerade formen av histon fyra vid specifika lysinrester avslöjade också skillnader i den meotiska spindelens morfologi och i det globala mönstret av histonacetylering. Slutligen undersöktes uttrycket av mRNA som kodar för histon-deacetylaser (HDAC) och acetyltransferaser (HAT) genom omvänd transkription och kvantitativ PCR (q-PCR). Inga skillnader i det relativa uttrycket av transkript observerades mellan in vitro och in vivo mogna oocyter. I överensstämmelse med en allmän tystnad av transkriptionsaktiviteten under oocytmognad kan analysen av det totala transkriptionsmängden endast avslöja mRNA-stabilitet eller nedbrytning. Dessa resultat tyder på att andra översättnings- och posttranslationella regler kan påverkas.
Sammanfattningsvis beskriver den föreliggande studien ett experimentellt tillvägagångssätt för att morfologiskt och biokemiskt karakterisera hästocyten, en ceLl typ som är extremt utmanande att studera på grund av låg tillgänglighet i provet. Det kan dock utöka vår kunskap om reproduktiv biologi och infertilitet hos monovulatoriska arter.
Introduction
Ett brett spektrum av assisterade reproduktionstekniker har utvecklats för att behandla infertilitet hos kvinnor, följeslagare och utrotningshotade arter. Ett av de vanligaste förfarandena i kliniska inställningar är hämtning av metafas II (MII) -stage-oocyter från äggstocksfolliklarna genom ultraljudstyrd transvaginal aspiration, upptagning av ägg (OPU) 1 . Dessa oocyter befruktas sedan in vitro (IVF), med det resulterande embryot (erna) implanterade i en mottagare uterus. MII-stegen (mogna) oocyter hämtas efter administrering av exogena gonadotropiner. Denna behandling är dock associerad, hos vissa patienter, med utvecklingen av ovarie hyperstimuleringssyndrom (OHSS) 2 .
Att utnyttja den inre förmågan hos fullvuxna, omogna oocyter (GV-scenen) för att spontant återuppta meioser, när de en gång är isolerade från deras folliklar, är det möjligt att erhålla mogna oocyter utan adminisGonadotropin 3 . Denna procedur kallas oocyt in vitro mognad (IVM) och representerar en mindre läkemedelsinriktad, billigare och mer patientvänlig inställning till assisterad reproduktiv teknik. Emellertid är framgången med embryonutveckling med in vitro- mättade oocyter generellt lägre än hos in vivo mogna oocyter 4 , 5 . En möjlig förklaring är att in vitro- mogna oocyter påverkas mer av fel i kromosomsegregation, och den resulterande aneuploidin försvårar normal embryonal utveckling 6 .
Förstå den molekylära grunden för kromosomal miss-segregering under IVM skulle i slutändan avslöja den fulla potentialen i denna teknik. I den här venen användes det experimentella tillvägagångssättet för att undersöka de morfologiska och biokemiska egenskaperna hos in vitro- malda oocyter jämfört med in vivo maturEd oocyter beskrivs här 7 , 8 . Specifikt illustreras procedurerna för OPU hos omogna och mogna oocyter och IVM hos omogna oocyter med användning av vuxna och naturligt cyklande hästar som en experimentell modell. Därefter används immunfluorescens och bildanalys för att undersöka kromosomsegregation, spindelmorfologi och det globala mönstret av histonacetylering på dessa gameter. Slutligen beskrivs ett protokoll med omvänt transkription och kvantitativ PCR för analys av mRNA-uttryck.
Jämfört med gnagodjurmodeller tillåter hästar inte genetisk manipulation, är mindre lätt att manipulera, och kräver dyrt underhåll. Emellertid får denna modell ett stort intresse för studien av oocytmognad 9 , 10 på grund av likheten med mänsklig äggstocksfysiologi 11 , 12 </ Sup>. Vidare har utvecklingen av tillförlitliga protokoll för IVM-IVF i hästen ett väsentligt ekonomiskt intresse, eftersom det skulle möjliggöra en ökning av antalet föl från marer med högt genetiskt värde.
En av begränsningarna för att utföra experiment på oocyter, särskilt i monovulatoriska arter, är det begränsade provets tillgänglighet. Denna gräns har övervinnats här genom att justera ett tillvägagångssätt, tidigare utvecklat i möss, till hästocyter 13 , 14 för att utföra kromosomräkning som minimerar provförlusten (se diskussionen för jämförelse med andra tillgängliga tekniker). Vidare har ett triple-fluorescensfärgningsprotokoll optimerats för att utföra flera analyser på samma prov, och q-PCR-analyser utfördes endast på pooler med endast 2 oocyter.
Sammantaget beskriver den föreliggande studien ett experimentellt tillvägagångssätt som syftar till att morfologiskt och biokemiskt chaRacterize hästen oocyt, en celltyp som är extremt utmanande att studera på grund av låg tillgänglighet. Det kan emellertid expandera vår kunskap om reproduktiv biologi och infertilitet hos monovulatoriska arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trots att IVM har utförts på hästar i över 20 år 16 , vet vi inte om oocyten kan vara ursprunget till embryonal aneuploidi, vilket har föreslagits för människor 17 . Anledningen är förmodligen att beredningen av oocytspridningar för kromosomräkning resulterar i avsevärd provförlust. Med detta i åtanke genomfördes en undersökning av metoderna för undersökning av fel i kromosomsegregation för att söka efter den lämpligaste tekniken för att applicera p?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna skulle vilja tacka Fabrice Vincent för supporten med laserscanning-konfokal mikroskopi (LSCM) , och Philippe Barrière och Thierry Blard för att utföra daglig ultraljud ovariescanning och hCG-injektion. Detta arbete stöddes delvis av projektet "Regione Sardegna och Regione Lombardia" "Ex Ovo Omnia" (bidrag nr 26096200 till AML). "L'Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012" gemenskap (kontrakt 2012 till FF), FP7-PEOPLE-2011-CIG, forskningsförvaltningsbyrån (REA) "Pro-Ovum" (bidrag nr 303640 till VL) Och av doktorandskolan för jordbruk och veterinärmedicin, medfinansierad av Europeiska socialfonden, sektors operativt program för mänsklig resursutveckling 2007-2013 (kontrakt nr POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 till IM). In vivo- oocytkollektionen finansierades av Institut Français du Cheval et de l'Equitation.
Materials
| ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
| human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
| detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
| butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
| stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
| butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
| benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
| TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
| Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
| 4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
| incubator | Heraeus | BB6060 | |
| monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
| TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
| Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
| ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
| mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
| rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
| AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
| Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
| mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
| SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
| specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
| thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
| mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
| mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 | |
Referências
- Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467 (1984).
- Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy. Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).
- Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta. Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).
- Requena, A. The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate. Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).
- Franciosi, F. In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes. Reprod Fertil Dev. , (2015).
- Franciosi, F. Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes. Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).
- Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology. , (2016).
- Hendriks, W. K. Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos. Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).
- Carnevale, E. M. The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).
- Ginther, O. J. The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women. Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs. Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).
- Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries. Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).
- Homer, H. A. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).
- Rambags, B. P. Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).
- Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity. J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).
- Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice. Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).
- Luzzo, K. M. High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects. PLoS One. 7 (11), e49217 (2012).
- Ma, P., Schultz, R. M. Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse. PLoS Genet. 9 (3), e1003377 (2013).
- Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).
- Luciano, A. M. Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B. Biol Reprod. 88 (3), 58 (2013).
- Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development. Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).
- Terzaghi, L. PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis. Cell Cycle. , 1-14 (2016).
- Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. Translation in the mammalian oocyte in space and time. Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).
- Chen, J. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).
- Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse. Biol Reprod. 88 (1), 11 (2013).
