वैश्विक बायोटिनिलेटेड Psoralen का उपयोग आरएनए-आरएनए अंतरण मैपिंग
Summary
यहां, हम एस की विधि एस एसरेलन क्रॉस्लेन्क्क्ड, एल इगेटिड, और एस चुने हुए एचबीबीडीएस (एसपीएलएचएच) की पहचान करते हैं, जो विवो में इंट्रामोलेक्यूलर और इंटरमॉलिक्युलर आरएनए-आरएनए इंटरैक्शन के जीनोम-विस्तृत मानचित्रण को सक्षम बनाता है। खमीर, बैक्टीरिया और मनुष्यों सहित जीवों के आरएनए इंटरएक्टॉम के अध्ययन के लिए स्पलाश लागू किया जा सकता है।
Abstract
जानने के लिए कि आरएनए स्वयं के साथ कैसे बातचीत करते हैं और दूसरों के साथ सेल में आरएनए आधारित जीन विनियमन को समझने की कुंजी है। आरएनए-आरएनए बातचीत के उदाहरणों में जैसे माइक्रोआरएनए-एमआरएनए बातचीत जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए दिखायी गई है, सेल में आरएनए की बातचीत पूरी तरह से पता नहीं है, अभी भी अज्ञात है। आरएनए की बातचीत का अध्ययन करने के लिए पूर्व विधियां मुख्य रूप से आरएनए के उपसंकल्प पर केंद्रित होती हैं जो एक विशेष प्रोटीन या आरएनए प्रजातियों के साथ बातचीत कर रहे हैं। यहां, हम एस के नाम से एक विधि का विस्तार करते हैं जिसमें पी सोरेलन क्रॉस्लेन्क्क्ड, एल इगेटेड, और एस चुने गए एचबीबीडीएस (एसपीएलएएसएच) की पहचान होती है जो एक निष्पक्ष तरीके से जीवाणु-व्यापक आरएनए बातचीत में विवो में कब्जा करने की अनुमति देता है। स्प्रैश ने विश्व स्तर पर इंट्रामोलेक्युलर और इंटरमॉलिक्युलर आरएनए बेस-पेयरिंग साझीदारों की पहचान करने के लिए विवो क्रॉस्लिंकिंग, निकटता लगीकरण, और उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण का इस्तेमाल किया है। स्प्लेस को जीवाणु, खमीर और मानव कोशिकाओं सहित विभिन्न जीवों पर भी लागू किया जा सकता हैविभिन्न सेलुलर संदर्भों के तहत आरएनए संगठन की गतिशीलता की समझ को सुविधाजनक बनाने के लिए विविध सेलुलर स्थितियां हैं। पूरे प्रायोगिक SPLASH प्रोटोकॉल को पूरा करने में लगभग 5 दिन लगते हैं और कम्प्यूटेशनल वर्कफ़्लो को पूरा होने में लगभग 7 दिन लगते हैं।
Introduction
सेल में जीन विनियमन को समझने की कुंजी है कि कैसे अणुओं को गुना और एक-दूसरे के साथ बातचीत करना महत्वपूर्ण है। डीएनए और प्रोटीन जीन विनियमन में कैसे योगदान करते हैं, यह समझने के लिए पिछले दशक में बहुत प्रयास किया गया है, अपेक्षाकृत कम जीन अभिव्यक्ति के बाद ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन के बारे में जाना जाता है। आरएनए अपने रेखीय अनुक्रम और उसकी माध्यमिक और तृतीयक संरचना 1 दोनों में जानकारी रखती है। विवो में अपने कार्य के लिए अपने साथ और अन्य लोगों के साथ अपनी जोड़ी बनाने की क्षमता महत्वपूर्ण है हाई थ्रूपुट आरएनए माध्यमिक संरचना की जांच में हालिया अग्रिमों ने प्रतिलिपि 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , हॉवे में डबल और एकल फंसे क्षेत्रों के स्थानों में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है।पेयरिंग इंटरेक्शन पार्टनर पर सूचनाएं अभी भी काफी हद तक गायब हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि ट्रांसनाइम में एक अन्य आरएनए क्षेत्र के साथ आरएनए अनुक्रम क्या कर रहा है, हमें वैश्विक जोड़ी-वार जानकारी की आवश्यकता है
वैश्विक, निष्पक्ष तरीके से जोड़-वार आरएनए बातचीत का मिलान पारंपरिक रूप से एक बड़ी चुनौती है। जबकि पिछले दृष्टिकोण, जैसे कि 9 9 एचएसीएलआईपी 10 और आरएपी 11 , बड़े पैमाने पर आरएनए बातचीत की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है, ये तकनीक आम तौर पर आरएनए के एक सबसेट के लिए आरएनए बेस जोड़ी का नक्शा करते हैं जो किसी विशेष प्रोटीन या आरएनए प्रजातियों के साथ बातचीत करते हैं। वैश्विक आरएनए बातचीत के अध्ययन में हाल के घटनाक्रम में आरपीएल 12 का तरीका शामिल है, जो कि विवो में आरएनए बातचीत को स्थिर नहीं करता है और इसलिए केवल विवो बातचीत में इसका एक सबसेट कैप्चर कर सकता है। इन चुनौतियों पर काबू पाने के लिए, हम और दूसरों ने जी के लिए जीनोम चौड़ा, निष्पक्ष रणनीति विकसित कीक्रॉस्लेंकर psoralen 13 , 14 , 15 के संशोधित संस्करणों का उपयोग करते हुए विवो में पी आरएनए इंटरएक्टॉम। इस प्रोटोकॉल में, हम पी सोरेलन क्रॉस्लेंक्क्ड, एल इगेटेड, और एस चुने हुए एचबीबीडीएस (एसपीएलएएसएच) के एस के समेकन करने के विवरण का वर्णन करते हैं, जो बायोटीनिलेटेड सोरेलन का उपयोग विवो में बेस युग्मन आरएनए को क्रॉसलिंक करने के लिए करता है, इसके बाद निकटता लगीकरण और उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण आरएनए आधार-जोड़ीदार भागीदारों जीनोम चौड़ा ( चित्रा 1 ) 15 की पहचान
इस पांडुलिपि में, हम सभ्य पक्षपाती कोशिकाओं का उपयोग करके SPLASH करने के चरणों का वर्णन करते हैं, इस स्थिति में हेला कोशिकाएं वही प्रोटोकॉल आसानी से निलंबन स्तनधारी कोशिकाओं और खमीर और बैक्टीरिया कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। संक्षेप में, हेला कोशिकाओं को बायोटिनिलेटेड psoralen के साथ व्यवहार किया जाता है और 365 एनएम पर विकिरणित किया जाता है ताकि विवो में आरएनए आधार जोड़े में बातचीत कर सकें।। तब आरएनए को कोशिकाओं से निकाला जाता है, स्ट्रेप्टिविडिन मोती का उपयोग करके क्रॉस्लेन्किंग क्षेत्र के लिए विखंडित और समृद्ध। आरएनए के टुकड़े परस्पर संबंधों को निकटता के बंधन का उपयोग करके एक साथ ligated और गहरी अनुक्रमण के लिए एक सीडीएनए पुस्तकालय में बनाया है। अनुक्रमित होने पर, चिरात्मक आरएनए को ट्रांस्क्रिप्टम / जीनोम पर मैप किए जाते हैं जो आरएनए इंटरैक्टिंग क्षेत्रों की पहचान करते हैं जो एक दूसरे के लिए बनती हैं हम स्ट्रॉश का उपयोग सफलतापूर्वक उपयोग किया है जिसमें आरआईए के विभिन्न वर्गों जैसे स्नोआरएनए, एलएनसीआरएनए और एमआरएनए जैसे इंट्रामोलेक्यूलर और इंटरमॉलिक्यूलर आरएनए बेस जोड़ी सहित खमीर और विभिन्न मानव कोशिकाओं में विवो में आरएनए के हजारों की बातचीत का पता लगाया गया है, ताकि संरचनात्मक संगठन और इंटरैक्शन पैटर्न की झलक मिल सके। सेल में आरएनए का
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम SPLASH के लिए प्रयोगात्मक और कम्प्यूटेशनल वर्कफ़्लो को विस्तार से वर्णन करते हैं, यह एक विधि है जो हमें जीन-वार आरएनए अंतरणों को एक जीनोम-व्यापी तरीके से पहचानने देती है। हमने सफलतापूर्वक जीवाणु, ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सूचनात्मक चर्चाओं के लिए वान प्रयोगशाला और नागराजन लैब के सदस्यों का धन्यवाद करते हैं। एन। नागरसान को ए * स्टार से फंडिंग द्वारा समर्थित है वाई। वैन को ए * स्टार और सोसाइटी इन साइंस-ब्रैंको वेइस फेलोशिप से फंडिंग द्वारा समर्थित है।
Materials
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10787026 | DNA ladder |
| 10 bp DNA ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10821-015 | DNA ladder |
| 20 % SDS solution | First BASE | BUF-2052-1L | |
| 20x SSC | First BASE | BUF-3050-20X1L | |
| 3.0 M Sodium Acetate Solution | First BASE | BUF-1151-1L-pH5.2 | Required for nucleic acid precipitation |
| 40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio-Rad | 1610145 | TBE Urea gel component |
| Ambion Buffer Kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM9010 | |
| Ammonium Persulfate, Molecular Grade | Promega | V3131 | TBE Urea gel component |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.1000 | RNA extraction |
| Single strand DNA ligase | Epicentre | CL9025K | CircLigase II ssDNA Ligase |
| Centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8160-96EA | Costar Spin-X centrifuge tube filters |
| D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE | Sigma-Aldrich | D5628-1G | For cell treatment |
| Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | Dark Reader DR89X Transilluminator | Blue light transilluminator |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | R0611 | Required for agarose gel electroporation |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Pan BioTech | P04-03500 | For Hela cell culture |
| Streptavidin magnetic beads | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 65002 | Dynabeads MyOne Streptavidin C1 |
| Magnetic stand for 15ml tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12301D | DynaMag-15 |
| Magnetic stand for 15ml tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12321D | DynaMag-2 |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382 000.015 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Biotinylated psoralen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 29986 | EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin |
| F8T5/BL | Hitachi | F8T5/BL | 365 nm UV bulb |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10270106 | Components of Hela medium |
| Formamide | Promega | H5052 | Component in hybridization buffer |
| G8T5 | Sankyo-Denki | G8T5 | 254 nm UV bulb |
| Glycogen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10814010 | Required for nucleic acid precipitation |
| Nanodrop | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Nanodrop 2000 | Spectrophotometer for nucleic acidquantification |
| Nuclease free water | First BASE | BUF-1180-500ml | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15140122 | Components of Hela medium |
| High-Fidelity DNA polymerase (2x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | F531L | Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) |
| Primers Set 1 | New England Biolabs | E7335L | PCR primers |
| DNA Gel Extraction Kit | QIAgen | 28106 | QIAquick Gel Extraction Kit |
| Fluorometric Quantification kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| RNA clean up kit | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit Silica-membrane column |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM2696 | SUPERase In |
| Reverse transcriptase | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 18080400 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix |
| Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies Holdings Pte Ltd | S11494 | SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | End repair enzyme |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | Enzyme for proximity ligation |
| T4 RNA Ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373L | Enzyme for adaptor ligation |
| Temed | Bio-Rad | 1610801 | TBE Urea gel component |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15596018 | TRIzol® Reagent for RNA extraction |
| Urea | First BASE | BIO-2070-5kg | |
| UV crosslinker | Stratagene | 400072 | UV Stratalinker 1800 |
| UV Transilluminator | UVP | 95-0417-01 | For visualizing of bands |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| DNA cleanup it | Zymo Research | D4004 | Zymo DNA concentrator-5 |
| List of software required | |||
| FastQC software | 0.11.4 | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
| SeqPrep software | 1.0.7 | https://github.com/jstjohn/SeqPrep | |
| BWA software | 0.7.12 | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | |
| SAMTOOLS software | 1.2.1 | http://www.htslib.org/ | |
| PULLSEQ software | 1.0.2 | https://github.com/bcthomas/pullseq | |
| STAR software | 2.5.0c | https://github.com/alexdobin/STAR | |
| rem_dups.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| find_chimeras.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| pickJunctionReads.awk AWK script | AWK GNU 4.1.2 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| Buffer composition | |||
| Elution buffer: | |||
| 0.3 M sodium acetate | |||
| Lysis Buffer: | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 10 mM EDTA | |||
| 1% SDS | |||
| Always add Superase-in fresh before use except when washing beads | |||
| Proteinase K Buffer | |||
| 100 mM NaCl | |||
| 10 mM TrisCl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 0.5% SDS | |||
| Hybridization Buffer | |||
| 750 mM NaCl | |||
| 1% SDS | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 15% formamide (store in the dark at 4 °C) | |||
| Always add Superase-in fresh before use | |||
| 2x SSC Wash Buffer | |||
| 2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) | |||
| 0.5% SDS | |||
| 2X RNA fragmentation buffer | |||
| 18mM MgCl2 | |||
| 450mM KCl | |||
| 300mM Tris-CL pH 8.3 | |||
| 2x RNA loading Dye: | |||
| 95% Formamide | |||
| 0.02% SDS | |||
| 0.02% bromophenol blue | |||
| 0.01% Xylene Cyanol | |||
| 1mM EDTA | |||
| 3' RNA adapter sequence | 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC | ||
| RT primer sequence | AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG |
Referências
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- Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
- Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
- Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
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- Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
- Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
- Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
- Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
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- Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).
