Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Published: May 24, 2017

doi:

Jong Ghut Ashley Aw, Yang Shen, Niranjan Nagarajan, Yue Wan

¹Stem Cell and Regenerative Biology, Genome Institute of Singapore,A*STAR, ²Computational and Systems Biology, Genome Institute of Singapore,A*STAR

Summary

Hier worden we gedetailleerd beschreven over de methode van S- vergelijking van P- soralen verknoopt, L igated en S gekozen H ybrids (SPLASH), die genoom-wide mapping van intramoleculaire en intermoleculaire RNA-RNA interacties in vivo mogelijk maakt . SPLASH kan toegepast worden om RNA-interacties van organismen te bestuderen, waaronder gist, bacteriën en mensen.

Abstract

Het weten hoe RNA's met zichzelf en met anderen interageren, is de sleutel tot het begrijpen van RNA-gebaseerde genregulering in de cel. Terwijl voorbeelden van RNA-RNA-interacties, zoals microRNA-mRNA-interacties, zijn aangetoond dat de expressie van genen wordt geregeld, is de volledige mate waarin RNA-interacties zich voordoen in de cel nog steeds onbekend. Eerdere methoden om RNA-interacties te bestuderen hebben voornamelijk betrekking op subsets van RNA's die interactie hebben met een bepaald eiwit- of RNA-soort. Hierin geven we een methode aan, genaamd S- vergelijking van P- soralen verknoopt, L igated, en S gekozen H ybrids (SPLASH), die genoom-breed vastleggen van RNA-interacties in vivo op een onpartijdige manier mogelijk maakt. SPLASH maakt gebruik van in vivo crosslinking, proximity ligatie en high throughput sequencing om wereldwijd intramoleculaire en intermoleculaire RNA base pairing partners te identificeren. SPLASH kan worden toegepast op verschillende organismen, waaronder bacteriën, gist en menselijke cellen, evenals aS diverse cellulaire condities om het begrip van de dynamiek van RNA organisatie onder diverse cellulaire contexten te vergemakkelijken. Het volledige experimentele SPLASH-protocol duurt ongeveer 5 dagen om te voltooien en de berekeningswerkstroom duurt ongeveer 7 dagen om te voltooien.

Introduction

Het bestuderen van hoe macromoleculen elkaar vouwen en interageren, is de sleutel tot het begrijpen van genregulering in de cel. Hoewel er in het afgelopen decennium veel moeite werd gelegd om te begrijpen hoe DNA en eiwitten bijdragen tot genregulatie, is er relatief minder bekend over posttranscriptie van genexpressie. RNA voert informatie in zowel zijn lineaire volgorde als in zijn secundaire en tertiaire structuur ¹ . Het vermogen om met zichzelf en met anderen te koppelen, is belangrijk voor zijn functie in vivo . Recente vooruitgang in high-through RNA secundaire structuuronderzoek heeft waardevolle inzicht gegeven in de locaties van dubbele en enkelstrengige gebieden in de transcriptome ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ , howeVer informatie over de pairing interaction partners is nog steeds grotendeels ontbreken. Om te bepalen welke RNA-sequentie in wisselwerking met een ander RNA-gebied in het transcriptomeet is, hebben we wereldwijde paar-wise informatie nodig.

Mapping pair-wise RNA interacties op een globale, onpartijdige manier is traditioneel een grote uitdaging geweest. Terwijl eerdere benaderingen, zoals CLASH ⁹ , hiCLIP ¹⁰ en RAP ¹¹ , worden gebruikt om RNA-interacties op grote schaal te identificeren, worden deze technieken typisch RNA-basisparen in kaart gebracht voor een subset van RNA's die ofwel interactie hebben met een bepaald eiwit of RNA-soort. Recente ontwikkelingen bij het bestuderen van globale RNA-interacties omvatten de methode RPL ¹² , die geen RNA-interacties in vivo stabiliseert en derhalve alleen een subset van in vivo interacties kan vastleggen. Om deze uitdagingen te overwinnen hebben we en anderen ontwikkeld genoom-brede, onbevooroordeelde strategieën voor maP RNA-interacties in vivo , onder gebruikmaking van gemodificeerde versies van de crosslinkerpsoralen ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ . In dit protocol beschrijven we de details voor het uitvoeren van S- vergelijking van P- soralen verknoopt, L igated en S gekozen H ybrids (SPLASH), die biotinyleerde psoralen gebruikt om RNA's in vivo te crosslinken, gevolgd door proximale ligatie en high-through sequencing naar Identificeer RNA base-pairing partners genoom breed ( figuur 1 ) ¹⁵ .

In dit manuscript beschrijven we de stappen om SPLASH uit te voeren met behulp van gekweekte aanhechtende cellen, in dit geval HeLa-cellen. Hetzelfde protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan suspensie zoogdiercellen en aan gist- en bacteriecellen. In het kort worden HeLa-cellen behandeld met biotinyleerde psoralen en bestraald bij 365 nm om interactie RNA-basisparen in vivo te crosslinken. De RNA's worden dan geëxtraheerd uit de cellen, gefragmenteerd en verrijkt voor verknopingsgebieden onder toepassing van streptavidine kralen. Interactieve RNA-fragmenten worden dan gelijktijdig gelijktijdig gelijktijdig gelegeerd en in een cDNA-bibliotheek gemaakt voor diepvolgorde. Bij sequentiebepaling worden de chimere RNA's op het transcriptoom / genoom toegewezen om de RNA-interactie-gebieden die met elkaar gepaard zijn te identificeren. We hebben SPLASH succesvol gebruikt om duizenden RNA-interacties in vivo te identificeren de gist en verschillende menselijke cellen, waaronder intramoleculaire en intermoleculaire RNA base pairing in diverse klassen van RNA's, zoals snoRNAs, lncRNAs en mRNAs, om te kijken naar de structurele organisatie en interactiepatronen Van RNA's in de cel.

Protocol

1. Behandeling van HeLa-cellen met biotinyleerde psoralen- en RNA-extractie Cultuur HeLa cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runder serum (FBS) en 1% penicilline streptomycine (PS) in een 10 cm plaat. Was de HeLa-cellen tweemaal met 5 ml 1x PBS. Draag de overmaat PBS volledig uit de schotel door de schotel verticaal te plaatsen gedurende 1 minuut. Voeg 1 ml PBS met 200 μM biotinyleerde psoralen en 0,01% w / v digitonine, gelijkmatig aan de…

Representative Results

Figuur 1 geeft de schematische weergave van de SPLASH workflow weer. Bij de toevoeging van biotinyleerde psoralen in aanwezigheid van 0,01% digitonine en UV-verknoping wordt het totale RNA uit de cellen geëxtraheerd en wordt een dot blot uitgevoerd om ervoor te zorgen dat verknoping van biotinyleerd aan het RNA efficiënt is gebeurd ( Figuur 2 ). We gebruiken biotinyleerde 20 base oligo's als positieve controles om de hoeve…

Discussion

Hier beschrijven we in detail de experimentele en computational workflow voor SPLASH, een methode die ons toelaat om paar-achtige RNA-interacties op een genoombreedte te identificeren. We hebben succesvol gebruik gemaakt van SPLASH in bacteriële, gist en menselijke culturen en anticiperen dat de strategie op grote schaal toegepast kan worden op diverse organismen onder verschillende cellulaire staten. Een van de kritieke stappen in het protocol is om te beginnen met tenminste 20 μg verknoopt RNA om voldoende materiaal…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken leden van het Wan lab en het Nagarajan lab voor informatieve discussies. N.Nagarajan wordt ondersteund door financiering van A * STAR. Y.Wan wordt ondersteund door financiering van A * STAR en Society in Science-Branco Weiss Fellowship.

Materials

1 Kb Plus DNA Ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10787026	DNA ladder
10 bp DNA ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10821-015	DNA ladder
20 % SDS solution	First BASE	BUF-2052-1L
20x SSC	First BASE	BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution	First BASE	BUF-1151-1L-pH5.2	Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1	Bio-Rad	1610145	TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade	Promega	V3131	TBE Urea gel component
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Chloroform	Merck	1.02445.1000	RNA extraction
Single strand DNA ligase	Epicentre	CL9025K	CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8160-96EA	Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE	Sigma-Aldrich	D5628-1G	For cell treatment
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	Dark Reader DR89X Transilluminator	Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6X)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	R0611	Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Pan BioTech	P04-03500	For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads	Life Technologies Holdings Pte Ltd	65002	Dynabeads MyOne Streptavidin C1
Magnetic stand for 15ml tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12301D	DynaMag-15
Magnetic stand for 15ml tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12321D	DynaMag-2
ThermoMixer	Eppendorf	5382 000.015	Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	29986	EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL	Hitachi	F8T5/BL	365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10270106	Components of Hela medium
Formamide	Promega	H5052	Component in hybridization buffer
G8T5	Sankyo-Denki	G8T5	254 nm UV bulb
Glycogen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10814010	Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Nanodrop 2000	Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water	First BASE	BUF-1180-500ml
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15140122	Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	F531L	Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1	New England Biolabs	E7335L	PCR primers
DNA Gel Extraction Kit	QIAgen	28106	QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Q32854	Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM2696	SUPERase In
Reverse transcriptase	Life Technologies Holdings Pte Ltd	18080400	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies Holdings Pte Ltd	S11494	SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L	End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L	Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ	New England Biolabs	M0373L	Enzyme for adaptor ligation
Temed	Bio-Rad	1610801	TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15596018	TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea	First BASE	BIO-2070-5kg
UV crosslinker	Stratagene	400072	UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator	UVP	95-0417-01	For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF	Sigma-Aldrich	X4126-10G
DNA cleanup it	Zymo Research	D4004	Zymo DNA concentrator-5

List of software required
FastQC software	0.11.4	http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software	1.0.7	https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software	0.7.12	http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software	1.2.1	http://www.htslib.org/
PULLSEQ software	1.0.2	https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software	2.5.0c	https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script	AWK GNU 4.1.2	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src

Buffer composition

Elution buffer:
0.3 M sodium acetate

Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads

Proteinase K Buffer
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS

Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use

2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS

2X RNA fragmentation buffer
18mM MgCl2
450mM KCl
300mM Tris-CL pH 8.3

2x RNA loading Dye:
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1mM EDTA

3' RNA adapter sequence	5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence	AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG

Referências

Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O’Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Aw, J. G. A., Shen, Y., Nagarajan, N., Wan, Y. Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen. J. Vis. Exp. (123), e55255, doi:10.3791/55255 (2017).