Differentiële scanning calorimetrie meet de thermische overgangstemperatuur (s) en de totale warmte-energie nodig is om een eiwit te denatureren. De resultaten worden gebruikt om de thermische stabiliteit van eiwitantigenen beoordelen vaccinformuleringen.
Differentiële scanning calorimetrie (DSC) is een analytische techniek die de molaire warmtecapaciteit van monsters als een functie van de temperatuur gemeten. Bij eiwitmonsters, DSC profielen bevatten informatie over thermische stabiliteit, en in zekere mate dient als structurele "vingerafdruk" die kunnen worden gebruikt om structurele conformatie beoordelen. Het is uitgevoerd met een differentiële scanning calorimeter dat de thermische overgangstemperatuur hoogte (smelttemperatuur, Tm) en de energie die nodig is om de interacties stabiliseert de tertiaire structuur verstoren (enthalpie, AH) van eiwitten. Vergelijkingen worden gemaakt tussen de formuleringen, alsmede de productie veel, en verschillen in de afgeleide waarden geven de verschillen in thermische stabiliteit en structurele conformatie. Gegevens ter illustratie van het gebruik van de DSC in een industriële omgeving voor de stabiliteit studies evenals het toezicht op de belangrijkste stappen in het productieproces worden geleverd als bewijs van de effectiviteit van deze proprotocol. In vergelijking met andere werkwijzen voor het beoordelen van de thermische stabiliteit van eiwitten conformaties, DSC is kosteneffectief, vergt weinig monstervoorbereiding stappen en ook volledig thermodynamische profiel van het eiwit ontvouwingsproces.
Differentiële scanning calorimetrie (DSC) is een experimentele methode die direct het verschil in warmte-energie opname plaatsvindt in een monster ten opzichte van een referentie tijdens een geregelde temperatuurverandering 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 meet , 10, 11, 12. Uitgevoerd in een differentiële scanning calorimeter, omvat de methode het introduceren van warmte-energie in een cel en een referentie-cel tegelijkertijd terwijl identieke verhoging van de temperatuur van beide cellen in de tijd 2, 13,14. Vanwege verschillen in de samenstelling van het monster en de referentie worden verschillende hoeveelheid energie nodig om de temperatuur van de cellen 2, 12, 13 te verhogen. Aldus wordt de overtollige hoeveelheid energie die nodig is ter compensatie van het temperatuurverschil tussen de cellen gemeten en is rechtstreeks gecorreleerd aan specifieke thermodynamische eigenschappen van het monster 1, 3.
In de jaren 1960, MJ O'Neil en E. Watson van Perkin Elmer ontwikkelde de eerste differentiële scanning calorimeter de warmtestroom van vaste materialen 2, 3, 4 meten. Parallel, PL Privalov en DR Monaseldze EL van het Institute of Physics, Republiek Georgië (voormalige Sovjet-Unie) een unieke differentiële adiabatische calorimeter die kunnen worden gebruikt for biochemisch onderzoek 5, 6. Vervolgens, team Andronikashvili bij het Institute of Physics, Republiek Georgië, meldde de warmtecapaciteit van biomoleculen zoals vezelachtige en bolvormige eiwitten, DNA en RNA behulp van DSC 7, 8, 9. Verschillende ploegen geleid door Sturtevant 10, 11, 12, 13 Brandts en Privalov 14, 15, 16 gericht op de ontwikkeling van de theorie en praktische toepassingen van DSC om de thermodynamische gegevens van eiwitontvouwende onderzoeken. De waarde van DSC bestuderen grote supramoleculaire structuren zoals fagen, chloroplast, fosfolipide vloeibare kristallen, en vlees eiwitten zijn ook gemeld 17 </ sup>, 18, 19, 20.
DSC is nu gemeengoed in farmaceutisch onderzoek en ontwikkeling worden voor de beoordeling van de thermische stabiliteit van biomoleculen, in het bijzonder eiwitten 1, 21, 22. Dit is vooral te wijten aan de vooruitgang in termen van gevoeligheid en automatisering van de instrumenten die worden gebruikt het experiment 23, 24 uit te voeren. Hier, het eindresultaat van de DSC experiment, namelijk molaire warmtecapaciteit als functie van de temperatuur, wordt gebruikt om de volgende thermodynamische parameters te schatten (verandering warmtecapaciteit (ΔCp), enthalpie (AH), entropie (AS) en Gibbs vrije energie (Ag)) met behulp van de onderstaande vergelijking:
eq1.jpg "/> (1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Waar Cp wordt gemeten warmtecapaciteit; q is de warmtestroom in het testmateriaal; T 0 en T zijn de eerste en laatste temperaturen van de overgang van respectievelijk 22, 25. Het is ook vermeldenswaard dat de vergelijkingen bovenstaande van toepassing op enkel-domein eiwitten die twee-staten-transitie en omkeerbare thermische ontvouwing 22 kan ondergaan. Analyse van meer complexe eiwitten (bijvoorbeeld niet-twee-state eiwitten en oligomeren) have gerapporteerd door Friere et al. 26; Johnson et al. 27; en Kasimova et al. 28.
Om te bepalen of een eiwit ondergaat twee-toestandsovergang of vormt tussenproducten tijdens de thermische denaturatie, het experimenteel afgeleide enthalpie (AH, ook wel calorimetrische enthalpie AH Cal) vergeleken met de enthalpie verkregen volgens de van't Hoff vergelijking hieronder gegeven (ook genoemd van't Hoff enthalpie, AH VH):
(6)
Waarbij Tm is de temperatuur middelpunt van de overgang, R de ideale gasconstante (1,987 cal mol -1 K -1) en Y de fractie van de eiwitpopulatie in ongevouwen toestand 16, 29. AlsAH VH gelijk aan AH Cal; of VH AH / AH Cal gelijk is aan 1, dan is de proteïne ondergaat een "alles-of-niets" overgang (dat wil zeggen twee-toestandsovergang) 16, 25, 29. Indien AH VH is dan AH Cal; of VH AH / AH Cal is dan 1, het eiwit ondergaat een niet-two-state overgang 16, 25, 29. De verhouding AH VH / AH Cal komt ook overeen met het aandeel van de eiwitstructuur die smelt als thermodynamische coöperatie eenheid of domein 26.
De thermodynamische parameters zoals hierboven genoemd Ag en AH nuttige informatie over de thermische stabiliteit van eiwitten, waaronder biologische 30. Toch zal de nadruk worden gelegd op Tm en de AH in deze publicatie, want zij zijn de gerapporteerde waarden voor dit protocol. Tm halverwege temperatuur van de overgang, waarbij de gevouwen en ontvouwen toestanden van het eiwit bij evenwicht (dwz Ag = 0) 25, 31. Hoe hoger de T m van een eiwit, hoe hoger de thermische stabiliteit 31. AH correspondeert met het oppervlak van de piek (en) van de warmtecapaciteit versus temperatuur diagram (ook bekend als thermogram) gegenereerd aan het einde van de DSC experiment 16, 25. Het is de energie die nodig is om eiwitten denatureren en kan worden gebruikt om de actieve fractie (F a) te schatten in een proteïne formulering (dat wil zeggen, het percentage eiwitten met actieve conformatie in een monster) met de volgende vergelijking:
jove_content ">Waar AH is de experimenteel afgeleide enthalpie van het eiwit monster en Q de enthalpie bepaald voor een goed gekarakteriseerde referentie- of gestandaardiseerde eiwit 22. De schatting van F een significant toezicht op de real-time stabiliteit van producten en uitvoeren stabiliteitsstudies onder stressomstandigheden zoals vereist ICH richtlijnen 32. Vergelijking van AH geeft ook informatie over de dichtheid van de tertiaire structuur van een eiwit conformatie 31.
Dit protocol Gegevens een beoordelingsprocedure voor de thermische stabiliteit van eiwitten in een industriële omgeving en is uitgebreid gebruikt voor het formuleren van vaccins. Het werd ontwikkeld met behulp van een geautomatiseerde differentiële scanning calorimeter die reproduceerbare resultaten produceert fof eiwit concentraties van slechts 300 ug / ml.
Deze procedure is met succes opgenomen in verschillende karakterisering testpakketten, waaronder de stabiliteit en de vergelijkbaarheid studies 21. Realtime stabiliteitsstudies wordt gebruikt om de DSC Tm bewaken, alsmede een schatting van de Fa van biologische tijd om hun houdbaarheid te bepalen. Met betrekking tot de vergelijkbaarheid wordt gebruikt om de impact van de werkwijze en inrichting verandering en het effect van belangrijke vervaardigingsstappen op de structurele conformatie van geproduceerde partijen beoordelen. Dit omvat normaliter de directe vergelijking van de AH van geproduceerde partij een referentie product dat is aangewezen als het ideale product. Bovendien heeft DSC bewezen een analysemiddel voor product formuleringsstudies 37 zijn. De Tm van een eiwit in verschillende buffers met verschillende concentraties kan worden gebruikt om de formulering die de stabiliteit te bepalen proffershet eiwit.
Om de betrouwbaarheid van deze methode en objectiviteit van de resultaten, is het belangrijk om testparameters consistent van gang tot gang in dezelfde studie (bv vaccinpreparaat studie). Echter, de procedure worden gewijzigd om verschillen in de fysische eigenschappen van verschillende eiwitten tegemoet. Een voorbeeld van een modificatie die gemaakt kan worden is het veranderen van de scansnelheid van het experiment 38, 39. Eiwitten die gevoelig zijn voor de vorming van aggregaten waren toen verwarmd werden sneller scansnelheid onderzocht (bijvoorbeeld 120 ° C / h) de bijdrage van aggregaten voor de thermische overgangsprofiel voorkomen en verstopping van de capillairen van de calorimeter. Het is vermeldenswaard dat het scannen van snelheid de uitkomst van een DSC experiment 38 kunnen beïnvloeden. Verbreding van de thermische overgangstemperatuur piek waargenomen met toenemende scansnelheden in sommige proeiwitten; echter, T m bleef redelijk constant 38. Bovendien is de dialyse en ontgassen stappen voor de bereiding van de monsters zijn ook zeer belangrijk voor nauwkeurige resultaten 31. Dialyse zorgt dat het enige verschil in de samenstelling van het monster en de buffer het eiwit; Aldus kan de overtollige warmte wordt geabsorbeerd door het monster worden toegeschreven aan de warmtecapaciteit van het eiwit. Ontgassing garandeert juiste omvang analyse, zoals de extrapolatie van de thermodynamische parameters neemt aan dat het ontvouwen gebeurtenis zich voordoet onder druk en constant volume 31. De constante druk gedeelte van de veronderstelling komt voor rekening van stikstof onder druk van het systeem als in punt 1.1 van de procedure.
In vergelijking met andere werkwijzen voor het bepalen van de stabiliteit van eiwitconformaties zoals Circulaire dichroïsme (CD) en fluorescentie spectroscopie, DSC biedt een aantal voordelen in een comcommerciële instelling met inbegrip van kosten en tijd te besparen. Enerzijds het adiabatische ontwerp van een differentiële scanning calorimeter maakt het meten van de thermische stabiliteit betere temperatuurregeling precisie vergeleken met metingen met instrumentatie voor CD en fluorescentie spectroscopie 6. Ten tweede, in tegenstelling tot CD, de nauwkeurigheid van DSC gegevens zijn niet afhankelijk van de heliciteit van de eiwitten 39, 40; echter CD biedt aanvullende informatie over het ontvouwen van de secundaire structuur, die complementair zijn aan de DSC 41 zou zijn. Bovendien, het onder druk zetten van de DSC systeem kunnen getest met een breed temperatuurbereik zonder verwarmen het monster; Aldus kan een groot aantal eiwitten worden getest door DSC.
Terwijl DSC is een relatief snelle en eenvoudige benadering van de thermische stabiliteit van biologische bepaling is niet zonder beperkingen. Ten eerste, de basislijn aftrekken stap introduceert een vorm van menselijke inconsequentie in de ruwe data-analyse; aldus kunnen verschillen in de resultaten worden waargenomen bij verschillende gebruikers. Ten tweede, differentiële scanning calorimeters hebben minimale concentratie grenzen die moeilijk te realiseren bij massaproductie schaal zou kunnen zijn. Ten derde, de AH van irreversibele thermische denaturatie is niet absoluut; hetgeen impliceert dat afgeleid Ag (een indicator van eiwitstabiliteit) in soortgelijke scenario misleidend kan zijn. Bovendien heeft de werkwijze het beste werkt voor gezuiverde monsters. Aanwezigheid van onzuiverheden kan ofwel leiden tot een verschuiving in de Tm of er een interactie met het eiwit te onderzoeken, of het uiterlijk van nieuwe thermische transities als er geen interactie. In ieder geval deze extra functies op de thermogrammen verkeerd kan worden toegeschreven aan monsters, waardoor de interpretatie van de resultaten beïnvloeden. Ondanks deze beperkingen DSC blijft een betrouwbare methode die gedetailleerde thermodynamische Inform kunnen biedene eiwitontvouwende proces indien goed 42 geïmplementeerd.
Concluderend DSC biedt aanzienlijke voordelen als een conformationeel uitlezing instrument vaccinproducten en hun tussenproducten. De twee parameters, Tm en AH, verzameld voor een reeks van veel hetzelfde product kan een empirische basislijn die kan worden gebruikt om het effect van procesveranderingen, formulering en bewaaromstandigheden op de tertiaire structuur en stabiliteit van eiwitten onderzocht worden en virale antigenen 21, 43.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs zijn zeer dankbaar voor Joseph Mancini (voorheen met GE Healthcare), Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments beperkte) voor hun rol in de installatie en training op de differentiële scanning calorimeter, Sasmit Deshmukh en Webster Magcalas voor hun discussies.
Differential Scanning Calorimeter | Malvern Instruments Ltd | 28428948 (Via GE Healthcare) | Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors. |
Contrad 100 | Decon Laboratories Inc | 1504 | Dilute with water to 20% before use |
500µL Polypropylene round bottom 96 well plate | Canadian Life Science | ML072100 | Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used |
MicroCal ThermoVac | Malvern Instruments Ltd | N/Ap | provided with the Cap VP DSC |
Biosafety cabinet | Labconco | Logic+ – A2 | biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation |
Slide-A-Lyzer dialysis cassette | Thermo Scientific | 66810 or 66380 | to equilibrate the sample and buffer |