Targeted<em> In Situ</em> mutagenèse de Histone gènes dans la levure bourgeonnante
Summary
A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.
Abstract
We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.
Introduction
Les quatre protéines histones fondamentales H2A, H2B, H3, H4 et jouent un rôle central dans le compactage, l'organisation, et la fonction des chromosomes eucaryotes. Deux ensembles de chacun de ces histones forment l'octamère d'histone, une bobine moléculaire qui dirige l'emballage de ~ 147 paires de bases d'ADN autour de lui – même, entraînant finalement la formation d'un nucléosome 1. Les nucléosomes sont des participants actifs dans une variété de processus basés sur chromosomiques, telles que la régulation de la transcription du gène et la formation de l'euchromatine et l'hétérochromatine dans les chromosomes, et en tant que tels ont fait l'objet d'intenses recherches au cours des dernières décennies. Un certain nombre de mécanismes ont été décrits par lequel nucléosomes peuvent être manipulées d'une manière qui peut faciliter l'exécution des processus spécifiques – ces mécanismes comprennent la modification post-traductionnelle de résidus d'histones, dépendant de l'ATP nucléosome remodelage, et la réorganisation de nucléosome ATP-indépendanteet montage / démontage 2, 3.
La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae est un organisme modèle particulièrement puissant pour la compréhension de la fonction histone dans les eucaryotes. Cela peut être attribué en grande partie au degré élevé de conservation évolutive des protéines histones dans tout le eucaryotes de domaine et la susceptibilité de la levure à une variété de expérimentale génétiques et biochimiques approches 4. approches Reverse-génétiques dans la levure ont été largement utilisés pour étudier les effets des mutations histones spécifiques sur divers aspects de la biologie de la chromatine. Pour ces types d'expériences, il est souvent préférable d'utiliser des cellules dans lesquelles les histones mutantes sont exprimées à partir de leur locus génomique natif, comme expression de plasmides autonomes peuvent conduire à des niveaux anormaux intracellulaires de protéines histones (en raison du nombre de plasmides différents dans les cellules) et la modification concomitante de la chromatine environnements, qui peut finalement confondre l'interprétation des résultats.
Ici, nous décrivons une technique basée sur la PCR qui permet de mutagénèse ciblée des gènes d'histones à leurs emplacements génomiques natifs qui ne nécessite pas d'étape et les résultats du clonage dans la génération de la mutation (s) désirée sans restes de séquences d'ADN exogènes dans le génome. Cette technique profite du système de recombinaison homologue efficace dans la levure et a plusieurs caractéristiques en commun avec d' autres techniques similaires développées par d' autres groupes – notamment le Delitto Perfetto, génomique (SSG) mutagenèse spécifique du site, et allèle basée sur la PCR-clonage gratuit méthodes de substitution 5, 6, 7. Cependant, la technique nous décrivons a un aspect qui le rend particulièrement bien adapté pour la mutagenèse des gènes d'histones. Dans les cellules de levure haploïdes, chacun des quatre histones est codé par deux non unllelic gènes et hautement homologues , par exemple, l' histone H3 sont codées par les gènes et HHT1 HHT2, ainsi que les cadres de lecture ouverts (ORF) des deux gènes sont plus de 90% identique dans la séquence. Ce degré élevé d'homologie peut compliquer les expériences conçues pour cibler précisément l'un des deux gènes d'histones codant pour la mutagenèse. Alors que les procédés mentionnés ci-dessus nécessitent souvent l'utilisation d'au moins certaines séquences dans l'ORF du gène cible pour conduire une recombinaison homologue, la technique que nous décrivons ici fait appel à des séquences flanquant les ORFs des gènes d'histones (qui partagent beaucoup moins d'homologie de séquence) pour l'étape de recombinaison, augmentant ainsi la probabilité de ciblage réussi de mutagénèse sur le lieu souhaité. En outre, les régions homologues qui animent la recombinaison peut être très vaste, ce qui contribue à l'efficacité de recombinaison homologue ciblée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le niveau élevé d'homologie de séquence entre les deux gènes non-alléliques codant pour chacune des quatre protéines histones fondamentales dans les cellules de S. cerevisiae haploïdes peut représenter un défi pour les chercheurs qui souhaitent cibler spécifiquement l' un des deux gènes pour la mutagenèse. Décrit précédemment levure méthodes de mutagenèse, y compris la Delitto Perfetto, génomique (SSG) mutagenèse spécifique du site, et les méthodes de remplacement de l'…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Reine Protacio for helpful comments during the preparation of this manuscript. We express our gratitude to the National Science Foundation (grants nos. 1243680 and 1613754) and the Hendrix College Odyssey Program for funding support.
Materials
| 1 kb DNA Ladder (DNA standards) | New England BioLabs | N3232L | |
| Agarose | Sigma | A5093-100G | |
| Boric Acid | Sigma | B0394-500G | |
| dNTP mix (10 mM each) | ThermoFisher Scientific | R0192 | |
| EDTA solution (0.5M, pH 8.0) | AmericanBio | AB00502-01000 | |
| Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | 16-100-824 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E4884-500G | |
| Lithium acetate dihydrate | Sigma | L6883-250G | |
| MyCycler Thermal Cycler | BioRad | 170-9703 | |
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma | P3640-1KG | |
| PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase) and 5X buffer | Fisher Scientific | 50-443-960 | |
| Salmon sperm DNA solution | ThermoFisher Scientific | 15632-011 | |
| Sigma 7-9 (Tris base, powder form) | Sigma | T1378-1KG | |
| Sodium acetate trihydrate | Sigma | 236500-500G | |
| Supra Sieve GPG Agarose (low metling temperature agarose) | AmericanBio | AB00985-00100 | |
| Taq Polymerase and 10X Buffer | New England BioLabs | M0273X | |
| Toothpicks | Fisher Scientific | S67859 | |
| Tris-HCl (1M, pH 8.0) | AmericanBio | AB14043-01000 | |
| a-D(+)-Glucose | Fisher Scientific | AC170080025 | for yeast media |
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | for yeast media |
| Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-2 | for YPD medium |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | DF0127-17-9 | for YPD medium |
| 4-aminobenzoic acid | Sigma | A9878-100G | for complete minimal dropout medium |
| Adenine | Sigma | A8626-100G | for complete minimal dropout medium |
| Glycine hydrochloride | Sigma | G2879-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Alanine | Sigma | A7627-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Arginine monohydrochloride | Sigma | A5131-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma | A8381-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Aspartic acid sodium salt monohydrate | Sigma | A6683-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma | G2128-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Glutamine | Sigma | G3126-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma | H8125-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Isoleucine | Sigma | I2752-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Leucine | Sigma | L8000-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma | L5626-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Methionine | Sigma | M9625-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Phenylalanine | Sigma | P2126-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Proline | Sigma | P0380-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Serine | Sigma | S4500-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Threonine | Sigma | T8625-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Tryptophan | Sigma | T0254-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Tyrosine | Sigma | T3754-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Valine | Sigma | V0500-100G | for complete minimal dropout medium |
| myo-Inositol | Sigma | I5125-100G | for complete minimal dropout medium |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | for complete minimal dropout medium |
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | for complete minimal dropout medium |
| Yeast Nitrogen Base | Fisher Scientific | DF0919-07-3 | for complete minimal dropout medium |
| 5-Fluoroorotic acid (5-FOA) | AmericanBio | AB04067-00005 | for 5-FOA medium |
Referências
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