मापने सेल प्रवास के लिए एक अनुकूलन चैंबर
Summary
इस प्रोटोकॉल chemoattractants है कि यह भी एक बहुलक मैट्रिक्स के बाहर एक दवा के प्रसार की दर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के जवाब में सेल प्रवास को मापने के लिए एक अनुकूलन विधि का विवरण।
Abstract
सेल प्रवास प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, विकास, और घाव भरने का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। सेल प्रवास एक जटिल प्रक्रिया है कि कोशिकाओं, बाह्य मैट्रिक्स, और घुलनशील और गैर-घुलनशील रासायनिक कारकों (जैसे, chemoattractants) के बीच बातचीत शामिल है। ऐसे Boyden चैम्बर परख, एक विभक्त के दोनों तरफ कोशिकाओं की गिनती से काम के रूप में कोशिकाओं, के पलायन को मापने के लिए मानक तरीकों। इन तकनीकों का उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं; हालांकि, वे विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए थोड़ा ज्यामितीय संशोधन की पेशकश करते हैं। इसके विपरीत, microfluidic उपकरणों घुलनशील कारकों 1, 2 की अनुकूलन एकाग्रता ढ़ाल के साथ सेल प्रवास निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, microfluidics आधारित assays बनाने के लिए तरीके जानने के लिए मुश्किल हो सकता है।
यहाँ, हम रासायनिक एकाग्रता ढ़ाल के जवाब में सेल प्रवास को मापने के लिए सेल संस्कृति कक्षों के निर्माण के लिए एक आसान विधि का वर्णन है। हमारे सेल MiGration चैम्बर विधि आवेदनों की एक किस्म के लिए सेल प्रवास का अध्ययन करने के क्रम में विभिन्न रेखीय एकाग्रता ढ़ाल बना सकते हैं। इस विधि का उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है और आम तौर पर स्नातक छात्रों द्वारा किया जाता है।
microchannel चैम्बर में अच्छी तरह से एक पेट्री डिश में अंतिम microchannel कक्ष के आकार में एक एक्रिलिक डालने रखकर बनाया गया था। इस के बाद, पाली (dimethylsiloxane) (PDMS) डालने के शीर्ष पर डाल दिया गया था। PDMS कड़ा करने के लिए अनुमति दी गई थी और तब सम्मिलित हटा दिया गया था। यह किसी भी वांछित आकार या आकार में कुओं के निर्माण के लिए अनुमति दी। कोशिकाओं बाद microchannel चैम्बर के लिए जोड़ा जा सकता है, और घुलनशील एजेंटों वांछित एजेंट में एक agarose ब्लॉक भिगोने से कुओं में से एक को जोड़ा जा सकता है। agarose ब्लॉक कुओं में से एक को जोड़ा गया है, और समय चूक छवियों आदेश सेल प्रवास यों तो में microchannel चैम्बर के लिए ले जाया जा सकता है। इस विधि के लिए बदलाव किसी दिए गए आवेदन के लिए बनाया जा सकता है, इस विधि hig बनानेhly अनुकूलन।
Introduction
In order for vital processes such as wound healing, immune responses, and embryonic development to occur, cell migration must take place. Cell migration involves the interaction between cells and neighboring cells, the extracellular matrix, and soluble chemical cues (attractants or repellants). As an example, in the process of wound healing, fibroblasts play an integral role in fibrogenesis and wound contraction, where the cells are recruited to the site of injury to synthesize collagen in order to form the extracellular matrix3. Numerous mechanisms behind the migration of fibroblasts to a wound site have been studied, and they include different mechanical, physical, electrical, and chemotactic factors4. Fibroblasts respond especially well to different concentration gradients of growth factors. These different growth factors work together to optimize tissue regeneration5. While observing the chemotactic response of fibroblasts to growth factor concentrations, one can study the pattern of directional migration of fibroblasts and how they orient themselves around physical obstacles in order to reach their destination. Therefore, the goals of this study were to first develop a system in which fibroblast growth could be tracked under guidance by physical barriers and to secondly model the growth of fibroblasts as they navigate through the system.
Currently, the Boyden chamber assay is the most widely used system to measure the migration of cells6. The Boyden chamber consists of a two-chamber multi-well plate where each well may contain medium with or without chemoattractants7. A filter membrane provides a porous interface between the two chambers in each well; this creates a barrier so that cells cannot pass through unless it is by active migration. Typically, for the Boyden chamber, a chemoattractant is added to the lower chamber, and the system is allowed to equilibrate to form a gradient between the upper and lower wells4. One problem with the Boyden chamber assay is that steep gradients end up forming along a single axis perpendicular with the surface of the membrane. This causes the difference in the chemoattractant concentration between the upper and lower wells to be a lower than what was originally expected. Due to this constraint, the Boyden chamber assay makes it hard to correlate specific cell responses with particular gradient characteristics, such as the slope and the concentration difference. Without these measurements, it is hard to study multi-gradient signal integration.
To address some of the constraints of the traditional Boyden chamber assay, microfluidic assays have been developed to form customizable concentration gradients1. Standard methods for creating microfluidic systems require clean rooms for lithographic techniques. These techniques can be difficult to learn especially in a standard classroom setting. Thus, we have designed a chamber system for measuring cell migration that can be made without using a clean room. Using our system, the wells of the assay can be adjusted to a preferred size, and a linear concentration gradient of customized slope can be produced. This allows for accurate measurement of chemotaxis from random movement. The design is an inexpensive and easy-to-use system to model cell growth in response to different chemical stimuli.
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे microchannel चैम्बर वृद्धि कारक है और chemoattractants के जवाब में सेल प्रवास दर का निर्धारण करने और एक बहुलक मैट्रिक्स से एक दवा के प्रसार की दर को मापने सहित प्रयोजनों के एक भीड़ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। य?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस परियोजना के लिए धन उपलब्ध कराने के लिए Clemson विश्वविद्यालय के क्रिएटिव जांच कार्यक्रम और NSF CBET1254609 स्वीकार करते हैं।
Materials
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036 | poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent |
| Acrylic Sheets | US Plastic | 44200 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 25373-041 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | FD20s-100MG | |
| Agarose, Type I, Low EEO | Sigma-Aldrich | A6013-100G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Fisher Scientific | 11965092 | Cell media components |
| Fetal Bovine Serium | Fisher Scientific | 16000036 | Cell media components |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15140148 | Cell media components |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP24384 | |
| EVOS XL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AME3300 | Instrument used for taking time-lapse images |
| Versa LASER | Universal Laser Systems, Inc. | Model number VLS2.30 | Laser cutter used for cutting plastic |
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