Эффективное Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток к NKX6-1<sup> +</sup> панкреатических Предшественники
Summary
Здесь мы опишем протокол 4 этапа к дифференцировке эмбриональных стволовых клеток человека к NKX6-1 + панкреатических клеток – предшественников в пробирке. Этот протокол может быть применен к различным плюрипотентных стволовых клеточных линий человека.
Abstract
Плюрипотентные стволовые клетки обладают способностью самостоятельно возобновлять и дифференцироваться в нескольких родословных, что делает их привлекательным источником для генерации панкреатических клеток-предшественников, которые могут быть использованы для изучения и дальнейшего лечения сахарного диабета. В данной статье рассматривается протокол дифференциации четыре этапа, предназначенный для создания панкреатических клеток-предшественников из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Этот протокол может быть применен к ряду человеческого плюрипотентных стволовых клеток (HPSC) линий. Подход, используемый для создания панкреатических клеток-предшественников, чтобы дифференцировать ЭСК точно моделировать основные этапы развития поджелудочной железы. Это начинается с индукцией окончательного эндодермы, что достигается посредством культивирования клеток в присутствии активин A, базовый фактор роста фибробластов (bFGF) и CHIR990210. Дальнейшая дифференциация и структурирование с фактор роста фибробластов 10 (Fgf10) и Dorsomorphin формирует клетки, напоминающие задней кишки. Добавление Сетчаткаовая кислота, башка, САНТ-1 и FGF10 различает клетки задней передней кишки в клетки поджелудочной железы, характерных энтодермы. И, наконец, сочетание эпидермального фактора роста (EGF), никотинамид и Noggin приводит к эффективной генерации Pdx1 + / NKX6-1 + клеток. Проточная цитометрия проводится для подтверждения экспрессии специфических маркеров на ключевых этапах развития поджелудочной железы. В Pdx1 + / NKX6-1 + панкреатические клетки – предшественники в конце 4 -й стадии, способные генерировать зрелые бета – клеток при трансплантации в иммунодефицитных мышей и может быть дополнительно дифференцированы , чтобы генерировать инсулин-продуцирующие клетки в пробирке. Таким образом, эффективная генерация Pdx1 + / NKX6-1 + панкреатические клетки – предшественники, как показано в этом протоколе, имеет большое значение , поскольку она обеспечивает платформу для изучения развития поджелудочной железы человека в пробирке и обеспечивает источник клеток с потенциалом дифференциации в -клетки, которые могли бы Э.В.entually использоваться для лечения сахарного диабета.
Introduction
Распространенность сахарного диабета возрастает , и в соответствии с Канадской ассоциации диабета, по оценкам, более 11 миллионов человек , в Канаде являются диабетическая или prediabetic, 5-10% этих лиц , имеющих сахарный диабет 1 типа (СД1) 1. СД1 является аутоиммунным заболеванием, которое вызывается разрушением продуцирующих инсулин бета-клеток, которые расположены в островках Лангерганса. В настоящее время, люди , живущие с СД1 требуют экзогенных источников инсулина 2. Несмотря на успехи в инсулинотерапии, у пациентов СД1 продолжают иметь трудное время регулируя уровень глюкозы в крови и продолжают страдать как гипо- и гипергликемии. Перспективной формой лечения для восстановления нормогликемии в СД1 является использование человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), которые могут быть использованы для создания неограниченный запас инсулина производства бета – клеток , как в естественных условиях и в пробирке 3, <sдо класса = "внешние ссылки"> 4, 5, 6, 7. Дифференциация ЭСК к бета-подобные клетки могли бы сделать возможным изучение диабета в пробирке, что позволяет для идентификации новых терапевтических мишеней для лечения диабета 2 типа и обеспечивают клетки для трансплантации пациентам СД1.
Самая успешная попытка генерации продуцирующих инсулин клеток из ЭСК в пробирке является резюмировать эмбриональных события , которые происходят во время развития поджелудочной железы 4, 5. Это включает в себя манипуляции различных сигнальных путей, чтобы точно моделировать основные этапы развивающейся поджелудочной железе. Поджелудочной развития начинается с индукцией окончательного энтодермы, которая характеризуется выражением CXCR4 и CD117 (c-KIT) 8, 9. Точное регулирование definitАйв организация энтодермы необходим для формирования кишечной трубки, который затем подвергается передне-к-задней и вентральной-дорсального кучность стрельбы. Спинной и брюшные панкреатические почки выходят из области задней кишки, выражающего поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки гомеобоксный ген (Pdx1), который необходим для развития поджелудочной железы 10. Спинной и брюшные почки предохранителей , чтобы сформировать поджелудочную железу, которая затем подвергается интенсивному эпителиальной ремоделирования и расширение 11. Стремление к эндокринную и экзокринной линии сопровождается поколением мультипотентных клеток – предшественников (ПДК) , которые выражают, среди прочего, транскрипционные факторы Pdx1, Nkx6.1 и Ptf1a 12, 13. ПДКп , которые станут эндокринные и протоковой клетки продолжают выражать Nkx6-1 при одновременном снижении экспрессии Ptf1a. В противоположность этому, клетки линии преемственности экзокринных потеряет expressioп Nkx6-1 и поддерживать Ptf1a выражение 12.
Фактор транскрипции Nkx6-1 играет ключевую роль в развитии рака поджелудочной, в частности , во время дифференцировки эндокринных клеток – предшественников к бета – клеток. Как было описано выше, удаление результатов Nkx6-1 в нарушенного формирования бета – клеток поджелудочной железы в процессе развития 14. Поэтому, создавая производящие инсулин бета – клеток в пробирке и в естественных условиях требует эффективной индукции Nkx6-1.
Недавно мы разработали протокол , чтобы эффективно генерировать Pdx1 + / NKX6-1 + панкреатических клеток – предшественников из hPSCs. Эти HPSC полученные из панкреатических прародителей образованием зрелых бета – клеток при трансплантации в иммунодефицитных мышей 3. Протокол дифференциации можно разделить на 4 этапа характеристику: 1) окончательной индукции энтодермы, 2) задняя передняя кишка структурирование, 3) поджелудочная спецификации и 4) NKX6-1 индукции. Здесь мы приводим подробное описание каждого шага направленной дифференцировки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Успешно генерации NKX6-1 + панкреатических клеток – предшественников из hPSCs в пробирке основана на использовании высоких культур качества hPSCs и направленной дифференцировки , включающих точное регулирование конкретных сигнальных путей , которые регулируют основные этапы разв?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта рукопись была поддержана финансирование из Торонто общего и Западного Фонда и Высшей премии Бантинг и Лучший Диабет Центр-университет сеть здравоохранения.
Materials
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
Referências
- Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
- Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
- Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
- Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
- Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004 (2012).
