에 의해 쥐 림프구 라벨링<sup> (64)</sup> CU-항체 수용체는 대한 타겟팅<em> 생체</em> PET / CT에 의한 세포 트래 피킹
Summary
형질 전환 쥐 T 세포 수용체에 결합하는 64의 Cu 변성 모노클로 날 항체의 제조에 이어 T 세포 생존, 기능, 표시 안정성과 세포 사멸 분석, 생체 내에서 방사성 표지하고, 적응 적기도 지연 형 과민 쥐에 옮기고 양전자 방출 단층 촬영 / 컴퓨터 단층 촬영 (PET / CT)에 의해 비 침습성 영상화 대한 반응.
Abstract
이 프로토콜은 구리 (64)의 제조 및 뮤린 림프구 세포 배양 및 세포 타겟팅 CU-64 수용체 항체에 따르는 단일 클론 항체 (항체)의 킬레이트 결합 / 방사성 표지를 나타낸다. PET / CT에 의한기도 지연 형 과민 반응 (DTHR)의 동물 모델에서 생체 세포와 방사성 추적 비 침습적 설명되는 시험 관내 평가.
구체적으로는, 킬레이트 1,4,7,10-1,4,7,10 테트라 아자 – 테트라 아세트산 (DOTA)와 항체의 결합을 나타낸다. 방사선 (64)의 Cu의 DOTA 공역의 방사성 표지 된 단클론 항체의 생산을하는 것은 다음을 설명한다. 다음에, 닭 오브 알부민 (코바) 특이 적 CD4 + 인터페론의 확장 (IFN)의 생산 -γ-T 헬퍼 세포 (COVA-TH1)과 코바-TH1 세포의 후속의 방사선은 도시된다. 다양한 체외 기술은 EF을 평가하기 위해 제시이러한 트리 판 블루 배제에 의한 세포 생존의 판정, 유동 세포 계측법 넥신 V와 아폽토시스에 대한 염색 및 IFN-γ 효소 면역 분석법에 의해 기능의 평가와 셀 64의 Cu-방사성 표지의 fects (ELISA) . 또한, 세포 내로 흡수하고 방사성 표지 안정성의 판정을 상세히 설명한다. 이 프로토콜은 상기 따라서, BALB / c 마우스에서 코바 유발 급성기도 DHTR의 유도가 포함되어기도 DTHR에 대한 동물 모델에서 세포 추적 연구를 수행하는 방법을 설명한다. 마지막으로, 이미지 획득, 재구성, 및 분석을 포함하는 강력 PET / CT 흐름이 제공된다.
후속 수용체 내재화와 CU-64 수용체 항체 타겟팅 방법은 셀 공통 표지 용 PET-트레이서에 비해 높은 안정성 및 특이성 감소 세포 독성, 낮은 유출 속도를 제공 예 64의 Cu-pyruvaldehyde 비스 (N4-methylthiosemicarbazone) (64 CU-PTSM). 마지막으로, 우리의 방법은 48 시간을위한 최적의 신호 대 백그라운드 비율 PET / CT 생체 내 세포 추적 비 침습적 수있다. 이러한 실험 방법은 내재화되는 막 결합 수용체와 동물 모델과 다른 종류의 세포에 전달 될 수있다.
Introduction
비 침습적 셀 추적은 생체 내에서 세포 기능, 이동과 원점을 모니터링하는 다용도 공구이다. 최근 세포 추적 연구는 재생 의학, 암 3, 4에 대한 입양 세포 치료에 염증이나 T 림프구에서자가 말초 백혈구의 맥락에서 중간 엽 1, 2 또는 골수 유래 줄기 세포 3에 초점을 맞추고있다. 행동의 사이트 및 세포 기반 치료의 기본 생물학적 원리의 해명은 엄청난 중요하다. CD8 + 세포 독성 T 림프구는 유전자 널리 금 표준으로 간주 하였다 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 또는 종양 침윤 림프구 (TILS)를 설계. 그러나, 종양 관련 항원 특이 TH1 세포는 <효과적인 대안 치료 옵션 4, 입증했다/ SUP> 5, 6, 7.
키 염증 플레이어, 기관 고유의자가 면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염 또는 기관지 천식), 암 면역 요법에 높은 관심의 세포, TH1 세포의 시간적 분포와 유도 패턴을 특성화하는 것이 중요하다. PET에 의한 비 침습적 생체 이미징 생체 원위치에서 세포의 이동 패턴을 조사하는 계량 고도로 민감한 방법 (8)을 제공하고, 염증, 알레르기, 감염 또는 종양 거부 9, 10, 11 중 T 세포의 작용과 반응 사이트.
임상 적으로, 인 옥신 (111)는 2- 데 옥시 -2- (18 동안, 염증 및 감염 (12)의 판정에 대한 백혈구 신티에 사용F) 플루오로 -D- 글루코스 (FDG-18 F)는 일반적으로 PET (3), 셀 (13)에 의해 추적 연구에 사용된다. 이 PET 추적자 하나의 큰 단점은, 그러나, 109.7 분의 핵종 18 F 이후 시점에서 촬상이 대체 세포 이동을 저해 게시 낮은 세포 내 안정성의 짧은 반감기이다. 세포 불안정하지만, 64의 Cu-PTSM 빈번하게하는 데 사용되는 PET 생체 내 세포 추적 연구에서 장기에 대해 비특이적 전지 (14), T 세포 생존에 최소화 해로운 효과 (15)에 라벨 (16) 기능을한다.
이 프로토콜은 또한 T 세포 수용체 (TCR) 특이 방사성 표지 된 항체를 이용하여 세포 생존 및 기능에 대한 불리한 영향을 줄이는 방법을 설명한다. 우선, 방사성 동위 원소 64의 Cu, 제 KJ1-26와 단클론 항체의 결합의 제조E DOTA 킬레이트 및 후속 CU-64 방사성 표지를 나타낸다. 제 2 단계에서, 상기 절연 및 DO11.10 공여 마우스의 코바-TH1 세포의 확장 및 64의 Cu-DOTA로드 공역 단클론 KJ1-26 (64 CU-DOTA-KJ1-26)와 방사성 표지를 상세히 설명한다. 흡수 값 및 도즈 교정과 방사능 유출과 각각 감마 계수에 의해 평가뿐만 아니라, IFN-γ ELISA가 제시와 트립 판 블루 배제 및 기능에 의한 세포 생존율의 64 CU-방사성 표지의 효과의 평가 . 생체 세포의 추적 비 침습적 들어, 대체 세포 전사 후에 PET / CT 의해 COVA 유발 급성기도 DTHR 및 이미지 획득의 마우스 모델의 도출을 설명한다.
또한,이 라벨 접근 방식은 다른 질병 모델, 다른 TCR도 또는 막 결합 수용체 또는 식 마르와 관심의 일반 세포와 쥐의 T 세포로 전송할 수 있습니다KERS 연속 막 (17)을 왕복 밑에.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 안정적으로 PET에 의해 생체 내 추적 세포를 방사성 표지하는 신뢰할 수있는 쉬운 방법을 제시한다. 64 CU-DOTA-KJ1-26 – 단클론 항체 및 그 유도와 방사성 표지 수, 코바-TH1 세포, 절연 및 기증자 마우스의 체외에서 확장이 방법을 수 활용하는 A의 코바 프레젠테이션의 사이트로 폐와 perithymic 림프절을 추적했다 급성기도 DTHR을 COVA 유도.
킬레이?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 실험 및 데이터 분석시 지원을 위해 박사 줄리아 만하임, 월터 에를리치만, 라모나 스텀, Funda 케이, 다니엘 부칼라, 마렌 하란트뿐만 아니라 나탈리 Altmeyer 감사합니다. 이 작품은 베르너 지멘스-재단, SFB685 통해 DFG (프로젝트 B6)과 재산 (2309-0-0)에 의해 지원되었다.
Materials
| HCl, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.00318 | 64Cu production |
| Methanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.06007 | 64Cu production |
| Isopropanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.0104 | 64Cu production |
| Pt/Ir (90/10) plate | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| PEEK chamber | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| 64Ni | Chemotrade | 64Cu production | |
| Polygram SIL G/UV 254 plate | Macherey-Nagel | 805021 | 64Cu production |
| Ion exchange column | BioRad | AG1-X8 | 64Cu production |
| Solid state target system for PETtrace | WKL | costum made | 64Cu production |
| 64Cu work-up module | WKL | costum made | 64Cu production |
| Dose calibrator | Capintec | CRC-25R | |
| PETtrace cyclotron | General Electric Medical Systems | ||
| DOTA-NHS | Macrocyclics | B-280 | DOTA-conjugation |
| Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) | Isolated from hybridoma cell culture | DOTA-conjugation | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA-conjugation |
| H+ Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA-conjugation |
| Amicon Ultra-15 filter unit | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA-conjugation |
| Rotipuran ultrapure water | Carl Roth | HN68.3 | DOTA-conjugation |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA-conjugation |
| PBS | University Tuebingen | DOTA-conjugation | |
| Micro Bio-spin P-6 column | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA-conjugation |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | DOTA-conjugation |
| Cyclone Plus PhosphorImager | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA-conjugation |
| DMEM | Merck Millipore | 102568 | ingredient for T cell medium |
| FCS | Merck Millipore | S0115/1004B | ingredient for T cell medium |
| Sodium pyruvate | Merck Millipore | L0473 | ingredient for T cell medium |
| MEM-amino acids | Merck Millipore | K0293 | ingredient for T cell medium |
| HEPES | Merck Millipore | L 1613 | ingredient for T cell medium |
| Penicillin/Streptomycin | Merck Millipore | A2212 | ingredient for T cell medium |
| 0.05 mM 2-β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | ingredient for T cell medium |
| DO11.10 mice | in-house breeding | TH1 cell culture | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 cell culture |
| Cell strainer 40 µm | Corning | 352340 | TH1 cell culture |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | TH1 cell culture |
| CD4 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 cell culture |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 cell culture |
| LS column | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 cell culture |
| anti-CD4 antibody (Gk1.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| anti-CD8 antibody (5367.2) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Anti-rat antibody (MAR18.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Rabbit complement MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1 cell culture |
| Anti-IL-4 antibody (11B11) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| cOVA 323-339-peptide | EMC-micro-collections | Custom order | TH1 cell culture |
| CPG1668-oligonucleotides | Eurofins MWG Operon | Custom order | TH1 cell culture |
| IL-2 | Novartis | 65483-116-07 | TH1 cell culture |
| 96-well plates | Greiner | 655180 | TH1 cell culture |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | TH1 cell culture |
| cell culture flask | Greiner | 660175 | TH1 cell culture |
| 48-well plates | Greiner | 677 180 | cell labeling |
| Gammacell 1000 | Best Theratronics | via inquiry | |
| Gulmay RT225 | Gulmay | via inquiry | |
| Trypan blue | Merck Millipore | L6323 | in vitro evaluation |
| Mouse IFN-γ ELISA | BD Biosciences | 558258 | in vitro evaluation |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 559763 | in vitro evaluation |
| Tube 5 ml | Sarstedt | 55.476 | in vitro evaluation |
| Round-bottom tubes | BD Biosciences | 352008 | in vitro evaluation |
| Wizard γ-counter | Perkin-Elmer | 2480-0010 | in vitro evaluation |
| ELISA Reader MultiscanEX | Thermo Fisher Scientific | 51118177 | in vitro evaluation |
| Microscope | Leica | via inquiry | in vitro evaluation |
| BD LSRII | BD Biosciences | via inquiry | in vitro evaluation |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | in vivo cell trafficking |
| Aluminum gel | Serva Electrophoresis | 12261.01 | in vivo cell trafficking |
| Xylazine | Bayer HealthCare | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Ketamine | Ratiopharm | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Isoflurane | CP-Pharma | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| 30G needle | BD Biosciences | 304000 | in vivo cell trafficking |
| Syringe | BD Biosciences | 11612491 | in vivo cell trafficking |
| Capillaries 10 µl | VWR | 612-2439 | |
| Inveon PET scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso |
| Inveon SPECT/CT scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking |
| Inveon Research Workplace | Siemens Healthineers | image analysis, alternative software: Pmod |
Referências
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