Um método completo para avaliar o<em> In Vivo</em> Performance of Cancer Nanomedicinas
Summary
The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.
Abstract
Inspirado pelo sucesso de nanomedicamentos câncer anteriores na clínica, os pesquisadores têm gerado um grande número de novas formulações na última década. No entanto, apenas um pequeno número de nanomedicamentos foram aprovados para uso clínico, ao passo que a maioria dos nanomedicamentos sob desenvolvimento clínico têm produzido resultados decepcionantes. Um grande obstáculo para a tradução clínica bem sucedida de novas nanomedicamentos câncer é a falta de uma compreensão exata do seu desempenho in vivo. Este artigo apresenta um procedimento rigoroso para caracterizar o comportamento in vivo de nanomedicamentos em ratinhos portadores de tumor em sistémica, de tecido, de uma única célula, e níveis sub-celulares através da integração da emissão de positrões tomografia computadorizada de tomografia (PET-CT), métodos de radioactividade quantificação , citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Usando essa abordagem, os pesquisadores podem avaliar com precisão novas formulações em nano-escala em modelos de ratos relevantes do cancer. Estes protocolos podem ter a capacidade de identificar os nanomedicamentos câncer mais promissores com alto potencial translacional ou para ajudar na otimização de nanomedicamentos cancerosas para tradução futuro.
Introduction
Nanomedicine está mudando o paradigma do desenvolvimento tratamento do câncer 1. Inspirado pelo impacto clínico enorme de nanomedicamentos câncer anteriores, como liposome- e nanotherapies à base de albumina 2, 3, muitas formulações inovadoras foram produzidas na última década. No entanto, estudos recentes do sucesso clínico tradução destes nanomedicamentos cancerosas indicam que apenas alguns deles têm sido aprovadas para o uso clínico de 4, 5. Um grande obstáculo para a tradução clínica de novas nanomedicamentos câncer é a sua melhoria limitada do índice terapêutico em comparação com a administração direta dos compostos terapêuticos livre 6. Como tal avaliação, exacta do comportamento in vivo de nanomedicamentos em sistémica, tecido, e níveis celulares em modelos animais pré-clínicos é essencial para identify aqueles com índices terapêuticos ideais para futura tradução clínica.
Nanomateriais podem ser radiomarcados para a caracterização quantitativa em animais vivos com a tomografia por emissão de pósitrons de imagem (PET), que tem excelente sensibilidade e reprodutibilidade entre todas as modalidades de imagem clínicos 7. Por exemplo, 89 Zr-marcado de longa circulação nanomedicamentos foram caracterizadas em modelos de ratinho para o cancro 8, 9, 10, bem como em outros modelos de doenças 11. Além disso, a semi-vida no sangue e a biodistribuição dos nanomedicamentos pode ser extensivamente avaliada pela utilização ex vivo medições de radioactividade em tecidos individuais 8. Portanto, a marcação radioactiva permite a avaliação quantitativa de nanomedicamentos em níveis sistémicos e tecidos.
Importante, radiolabeled nanomedicamentos geralmente não podem ser analisados no unicelular ou níveis subcelulares devido à limitada resolução espacial do sinal radioactivo. Assim, a rotulagem fluorescente revela-se uma modalidade complementar para a avaliação de nanopartículas com técnicas de imagiologia óptica, tais como citometria de fluxo e microscopia de fluorescência 12. Para este fim, as nanopartículas marcadas com radioisótopos e marcadores fluorescentes podem ser quantitativamente avaliado in vivo por imagiologia nuclear e ex vivo por contagem de radioactividade, e que também pode ser amplamente caracterizada a nível celular por imagiologia óptica.
Anteriormente, temos desenvolvido procedimentos modulares para incorporar marcadores radioactivos e fluorescentes em várias nanopartículas, incluindo a lipoproteína de alta densidade (HDL), 11, 9, 10 lipossomas, nanopartículas poliméricas, fragmentos de anticorpo, e nanoemulsions 10, 13. Estas nanopartículas marcadas têm permitido a caracterização quantitativa em modelos animais relevantes em diferentes níveis, que orientaram a otimização desses nanomateriais para suas aplicações específicas. No estudo atual, o objetivo é usar nanopartículas-lipossomal plataforma nanomedicina mais estabelecido 14 -como um exemplo para demonstrar os procedimentos abrangentes para gerar uma nanopartícula duplamente marcada e caracterizá-la completamente em um melanoma singênica rato modelo B16-F10 clássico 15 . A partir dos resultados, estamos confiantes de que essa abordagem caracterização de nanopartículas pode ser adaptado para avaliar outros nanomedicamentos cancerosas em modelos relevantes do mouse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passos críticos dentro do Protocolo:
A elevada qualidade dos lipossomas duplamente marcadas é a chave para a produção de resultados consistentes durante um longo período de tempo. Corantes fluorescentes livres ou 89 iões Zr pode gerar totalmente diferentes padrões de segmentação e tem de ser completamente removido durante o passo de purificação. Além disso, se o sistema imunológico afecta significativamente o desempenho experimental nanomedicina cancro, a utilização de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Drs. Helene Salmon and Miriam Merad from Icahn School of Medicine at Mount Sinai for providing the B16-F10-YFP cells and for their expert advice on melanoma mouse models. The authors further thank the Animal Imaging Core Facility, the Radiochemistry and Molecular Imaging Probes Core Facility, and the Molecular Cytology Core Facility at Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) for their support. This work was supported by National Institutes of Health grants NIH 1 R01 HL125703 (W.J.M.M.), R01CA155432 (W.J.M.M.), K25 EB016673 (T.R.) and P30 CA008748 (MSK Center Grant). The authors also thank the Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT) at MSK for their financial support (T.R.).
Materials
| DPPC | Avantilipids | 850355 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DSPE-PEG2000 | Avantilipids | 880120P | |
| DSPE-DFO | Home made | 110634 | Perez-Medina et al, JNM, 2014 |
| DiIC12[5]-DS | AAT Bioquest | 22051 | |
| Centrifugal filter | Vivaproducts | VS2061 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-100 | |
| Radio-HPLC | Shimadzu HPLC with 2 LC-10AT pumps | N/A | |
| 89Zr-oxalate | MSKCC | Synthesized in house | TR19/9 variable beam cyclotron (Ebco Industries Inc) |
| Micro PET-CT | Siemens | Inveon Micro-PET/CT | |
| Gamma counter | PerkinElmer | 2470-0150 | |
| Flow cytometry | BD Biosciences | Fortessa | Any multi-parametric flow cytometry analyzers would suffice |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | ||
| B16-YFP melanoma cells | Home made | N/A | Salmon et al, Immunity, 2016 |
| Ly6C (clone HK1.4)–APC-Cy7 | 128025 | Biolegend | |
| MHCII (M5/114/152)–APC | 107613 | Biolegend | |
| CD45 (30-F11)–BV510 | 103137 | Biolegend | |
| CD64 (X54-5/7.1)–PE-Cy7 | 139313 | Biolegend | |
| CD11b (M1/70)–BV605 | 101237 | Biolegend | |
| CD3 (17A2)–BV711 | 100241 | Biolegend | |
| CD31 (13.3)–PE | 561073 | Biolegend | |
| CD11c (M418)–PerCP-Cy5.5 | 117327 | BD Biosciences | |
| CD31 (13.3) no fluorophore | 550274 | BD Biosciences |
Referências
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