نظام الثقافة 3D على أساس إدراج تصفية السريع لالبروستاتا الابتدائية تمايز الخلايا
Summary
Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.
Abstract
الخلايا المعاد برمجتها مشروط (مراكز التأهيل المجتمعي) توفر طريقة مستدامة لزراعة الخلايا الأولية والقدرة على تطوير "المصارف البيولوجية الحية" واسعة من المريض المستمدة من خطوط الخلايا. لأنواع عديدة من الخلايا الظهارية، وقد وصفت مختلف المناهج ثلاثية الأبعاد، (3D) الثقافة التي تدعم تحسين حالة متباينة. بينما مراكز التأهيل المجتمعي تحتفظ التزام نسبهم إلى الأنسجة التي تكون معزولة، فإنها تفشل في التعبير عن العديد من علامات التمايز المرتبطة الأنسجة الأصلية عندما نمت في ظل شرطين الأبعاد (2D) ثقافة العادية. لتعزيز تطبيق مراكز التأهيل المجتمعي المستمدة من المريض لأبحاث السرطان البروستاتا، وقد تم تحديد شكل ثقافة 3D تمكن السريع (2 أسابيع الإجمالي) اللمعية تمايز الخلايا في كل من الخلايا الظهارية البروستاتا العادية والمشتقة من الورم. هنا، يتم وصف شكل على أساس إدراج مرشح للزراعة والتفريق بين كل من مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا الطبيعية والخبيثة. وديويقدم وصفا الذيل من الإجراءات المطلوبة لجمع الخلايا وتجهيزها لتلطيخ المناعى ومناعي. بشكل جماعي شكل ثقافة 3D وصفها، جنبا إلى جنب مع خطوط اتفاقية حقوق الطفل الأساسية، يوفر متوسطة المهم تسليط نظام نموذجي الخرج للبحث البروستاتا القائم على biospecimen.
Introduction
تحديد واستخدام علاجات السرطان التي يتم الشخصية للأفراد هي الهدف الأساسي في أبحاث السرطان. مؤخرا، تم وضع مناهج جديدة تسمح لسهولة أكبر في إنشاء مزارع الخلايا الأولية، وتوفير يحتمل سبل كلا تحديد واختبار علاجات شخصية. على سبيل المثال، البروستاتا استنادا R-spondin-نهج عضوي الشكل 1 يسمح للثلاثي الأبعاد (3D) زراعة خلايا سرطان البروستاتا العادية والمنتشر في المصفوفة خارج الخلية التجارية (على سبيل المثال، Matrigel)، في حين أن مشروطة إعادة برمجة خلايا (CRC) طريقة وضعت في جورج تاون 2، 3 ويستخدم أكثر من الشروط ثقافة 2D القياسية. على وجه التحديد، والجمع بين كيناز رو (Y-27632) والخلايا الليفية تغذية الفئران J2 المشع يؤدي إلى زراعة غير محددة من مراكز التأهيل المجتمعي القرنية 2. منهجية اتفاقية حقوق الطفل هيقوية للغاية، مع خطوط الخلايا الأولية إنشاء بنجاح والحفاظ عليها إلى ما لا نهاية من البروستاتا وغيرها من العديد من الأنسجة الطلائية العادية والخبيثة 3. الأهم من ذلك، تكنولوجيا CRC لدينا سمحت للالتعرف السريع على أساس المسببة لحليمي الجهاز التنفسي المتكررة في المريض الذي قد فشل عدد من العلاجات الدوائية السابقة. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام مراكز التأهيل المجتمعي العادية والمشتقة من الورم، وافق على تحديد الناجح لادارة الاغذية والعقاقير المخدرات، vorinostat، قدم في غضون أسبوعين من خزعة الأنسجة الأولي. تم وضع المريض على vorinostat، مما أدى إلى نجاح العلاج من المرض (4).
وتتألف غدة البروستاتا الطبيعية من اللمعية، القاعدية والخلايا الغدد الصم العصبية النادرة 5. الخلايا اللمعية تشكل طبقة الطلائية للغدة وتعبر عن مستقبلات الاندروجين (AR)، فضلا عن غيرها من علامات اللمعية مثل cytokeratins 8 و 18 و المؤيدمستضد محددة للدولة (PSA) 6. على العكس من ذلك، يتم ترجمة الخلايا القاعدية تحت طبقة اللمعية والتعبير عن cytokeratin 5 و p63، ولكن انخفاض مستويات ع 5. لدينا 7، استخدمت 8 و 9 و 10 آخرين بنجاح مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا في التحقيقات حساسية العقاقير الميكانيكية قبل السريرية. ومع ذلك، عندما نمت في ظل ظروف زراعة الأنسجة 2D القياسية، تفشل هذه الخلايا بشكل كامل الانخراط AR يشير 10. الأهم من ذلك، عندما وضعت تحت كبسولة الكلى من الفئران العوز المناعي، استعاد مراكز التأهيل المجتمعي العادية البروستاتا العمارة غدي وظيفة مشيرا إلى أن مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا تحتفظ التزام نسبهم عند وضعها في بيئة متساهلة. تطوير نظام زراعة الخلايا استنادا إدراج مرشح الموصوفة هنا تسمح لالسريعة (2 أسابيع) في المختبر التفريق بين مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا وب يتضحذ زيادة التعبير عن الجينات المستهدفة AR AR وكذلك انخفاض مستويات p63.
لإدراج مرشح المستخدمة تحتوي على أغشية البولي (حجم المسام، 0.4 ميكرومتر) التي يمكن أن تدعم زراعة الخلايا الثديية. النظام، كما وضعت، يجعل من استخدام مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا الطبيعية والخبيثة، أطباق ثقافة 6 جيدا وإدراج مرشح. وسائل الإعلام ثقافة الخلية مكيفة من قبل خلايا J2 11 يوضع في الغرفة والبروستاتا التفريق وسائل الإعلام القاع في الغرفة العليا. وصف تقنيات تدعم هذه الوثيقة البروستاتا اللمعية تمايز الخلايا في إطار زمني 2 الأسبوع، بما يتفق مع أهداف الطب الشخصي. وكان أيضا لا بد من تطوير المنهجيات التي تسمح للتنميط شامل الجزيئي، وراثي والخلوية من الثقافات. وقد تم تطوير المناهج لعزل DNA و RNA والبروتين من الخلايا التي صدرت من سطح مرشح ومبسطة لتجهيز العينات دقيقة تكرار. فيناLLY، والمنهجية اللازمة لإزالة مرشح لتمكين التضمين، باجتزاء ول H & E، المناعى وتلطيخ مناعي، يتم وصفه.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوط الخلايا الأولية هي منصة هامة والتطور السريع لأبحاث السرطان. نظام الثقافة 3D على أساس إدراج الثقافة يدعم التفريق بين مراكز التأهيل المجتمعي البروستاتا الابتدائية في إطار زمني لمدة أسبوعين. يمثل طريقة تصفية اتفاقية حقوق الطفل، طريقة الإنتاجية المتوسطة جديد للبح?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل T32 (CA 9686-18) وTL1 (TL1TR001431) جوائز تدريب ما بعد الدكتوراه منحة (LT)، وزارة الدفاع PC140268 (CA)، W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA)، وكذلك U01 PAR-12-095 (كومار) وCA051008-21 P30 (وينر). تم إجراء تثبيت العينة، باجتزاء وتلطيخ في لومباردي الشامل للسرطان مركز علم الأنسجة والموارد المشتركة الأنسجة. نشكر ريتشارد شليغل لإجراء مناقشات مفيدة. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني للسرطان أو المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
Referências
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Yuan, H., et al. Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).
- Signoretti, S., et al. p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).
- Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. Prostate cancer stem cells. J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).
- Ringer, L., et al. The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).
- Pollock, C. B., et al. Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).
- Crogliom, M., et al. Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair. Oncotarget. , (2016).
- Saeed, K., et al. Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer. Eur Urol. , (2016).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. J Vis Exp. (99), e52868 (2015).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
