기본 전립선 세포 분화에 대한 신속한 필터 삽입 기반의 3D 문화 시스템
Summary
Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.
Abstract
조건부 재 프로그램 세포 (CRC가)는 차 세포 배양 및 환자 유래 세포 라인의 광범위한 "살아있는 바이오 뱅크"를 개발 할 수있는 능력에 대한 지속 가능한 방법을 제공한다. 상피 세포의 많은 유형의 다양한 삼차원 (3D) 배양 방법은 개선 된 분화 상태를 지원하는 것을 설명 하였다. CRC가 그들이 절연되어있는 조직에 자신의 혈통의 의지를 유지하는 동안, 그들은 보통 두 개의 차원 (2D) 배양 조건 하에서 성장하는 경우 원산지의 조직과 관련된 분화 마커의 많은 표현하지 못한다. 전립선 암 연구 환자 유래의 CRC의 적용을 강화하기 위해, 3 차원 배양 포맷은 정상 및 종양 유래 전립선 상피 세포 모두에서 급속한 (2 주 전체) 내강 세포 분화를 가능하게한다는 정의되었다. 여기서, 필터 삽입 기반 포맷은 정상 및 악성 전립선 CRC가 양자의 배양과 분화를 위해 설명된다. 드면역 조직 화학 및 면역 형광 염색 세포 수집 및 처리에 필요한 절차 꼬리 설명이 제공됩니다. 총체적으로 기본 CRC 라인과 함께 설명 된 3D 배양 형식은 biospecimen 기반 전립선 연구 처리량 모델 시스템을 릅니 중요한 중간을 제공한다.
Introduction
개인에게 개인화 된 식별 및 암 치료의 사용은 암 연구의 주요 목표입니다. 최근, 새로운 접근법은 잠재적 모두 파악하고 맞춤형 치료를 테스트하는 방법을 제공하는 일차 세포 배양 확립 더 큰 용이성을 허용 개발되었다. 예를 들어, R-spondin 기반 전립선 organoid 접근법 1 허용 상용 외 매트릭스에서 정상 및 전이성 전립선 암 세포의 3 차원 배양 (예, 마트 리겔)에 대한 세포의 조건부 재 프로그래밍 (CRC) 법 반면 조지 타운 2에서 개발, 3 개 표준 2 차원 배양 조건을 사용한다. 구체적으로는, Rho 키나아제 억제제 (Y-27632) 및 조사 J2 뮤린 섬유 모세포 피더 세포의 결합은 각질 세포의 CRC가이 부정 배양 이어질. 상기 CRC 방법은매우 강력한 일차 전지 라인이 성공적으로 설립 전립선 및 기타 여러 정상 및 악성 상피 조직 (3)로부터 무기한 유지와 함께. 중요한 것은, 우리의 CRC 기술은 이전의 약물 치료의 숫자를 실패한 환자에서 재발 성 호흡기 유두종의 병인으로의 신속한 식별을 허용했다. 또한, 정상 및 종양 유래의 CRC를 사용하여, FDA의 성공적인 식별 초기 조직 생검의 2 주 이내에되었다, vorinostat을 약물을 승인했다. 환자들은 질환 (4)의 성공적인 치료 결과 vorinostat에 넣었다.
정상적인 전립선은 내강, 기초 및 희귀 신경 내분비 세포 (5)으로 구성되어 있습니다. 내강 세포 선의 원주 상피 층을 형성하고, 안드로겐 수용체 (AR),뿐만 아니라 8 및 18 cytokeratins 친 다른 내강 마커를 발현국가 특이 항원 (PSA) 6. 역으로, 기저 세포 내강 층 아래에 지역화 및 사이토 케라틴 5 P63 있지만, AR (5)의 낮은 레벨을 표현한다. 우리는 7, 8, 9, 10 등을 성공적 임상 약물 역학적 감도 연구에서 전립선의 CRC를 사용했다. 2D 표준 조직 배양 조건 하에서 성장 된 경우에는, 이들 세포가 완전히 열 신호 AR 맞물린 못한다. 면역 결핍 쥐의 신장 캡슐 아래에 위치 할 때 중요한 점은 CRC가이 허용 환경에 배치 할 때 전립선 CRC가 자신의 혈통의 의지를 유지할 것을 나타내는 정상 전립선 선의 구조와 기능을 회복했습니다. 여기에 설명 된 필터 인서트 계 세포 배양 시스템의 개발이 급속 (2 주)를위한 증명 B와 같은 전립선의 CRC의 체외 분화를 허용Y 증가 아칸소와 AR 대상 유전자의 발현도 감소 등의 P63 수준.
사용되는 필터 삽입은 포유 동물 세포의 배양을지지 할 수 카보네이트 멤브레인 (기공 크기 0.4 ㎛의)을 포함한다. 시스템이 개발로, 정상 및 악성 전립선 CRC로 6 웰 배양 접시 필터 인서트를 사용한다. J2 전지 (11)에 의해 조절 된 세포 배지는 상부 챔버 하부 측실 전립선 분화 배지에서 배치된다. 기술은 본원 맞춤 의학의 목적과 일치하는 2 주 기간 내에 전립선 내강 세포 분화를 지원 설명한다. 문화의 포괄적 인 분자 유전 학적 및 세포 프로파일을 허용 방법론을 개발하는 것이 필수적이었다. 필터 표면으로부터 방출 세포에서 DNA, RNA 및 단백질을 분리하는 방법을 개발하고 정확한 반복 시료 처리 간소화되었다. FINA에서야 베드로, 방법론은 H & E, 면역 조직 화학 및 면역 형광 염색, 삽입을 사용할 수 있도록 필터를 제거 절편과 필요한 완전히 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
일차 세포주 암 연구의 중요하고 빠르게 개발 플랫폼이다. 배양 인서트 기반 3 차원 배양 시스템은 2 주 기간 내에 기본 전립선 CRC로의 분화를 지원한다. 상기 CRC 필터 방법은 전립선 연구를위한 새로운 중간 처리량 방법을 나타낸다. 기존 마우스 PDX 모델은 시간 소모적이며 매우 비싸고, 상기 PDX 샘플의 많은 연구자 시작한 실험과 그 유용성을 제한 배양에서 성장 될 수 없다. PDX 확립의 성공률을 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 T32 (CA 9686-18) 및 TL1 (TL1TR001431) 박사 교육 그랜트 상 (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA)뿐만 아니라 의해 지원되었다 U01 PAR-12-095 (쿠마)와 P30의 CA051008-21 (와이너). 샘플 고정, 절편 및 염색은 롬바르디 종합 암 센터의 조직학 및 조직 공유 자원에서 수행되었다. 우리는 도움이 토론 리처드 슈레 겔 제품 개발 부사장 감사합니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 암 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
Referências
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