Быстрой патрон фильтра на основе 3D-система для первичной культуры клеток простаты дифференциацию
Summary
Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.
Abstract
Перепрограммировать клетки условно (ЗПК) обеспечивают устойчивый метод для первичной культуры клеток и способности развивать обширные «живой» биобанках пациента клеточных линиях. Для многих типов эпителиальных клеток, различные трехмерные подходы (3D) культуры было описано, что поддерживают улучшенное дифференцированное состояние. В то время как вычисление контрольной суммы сохраняют свою коммитирование к ткани, из которой они изолированы, они не выражают многие из маркеров дифференцировки, ассоциированных с тканью происхождения при выращивании в нормальных условиях двух двухмерных (2D) культуры. Для повышения применение ОЦР пациента, полученных для исследования рака простаты, 3D-формат культура была определена, что позволяет быстро (за 2 недели всего) люминальную дифференцировки клеток в нормальных и опухолевых полученных эпителиальных клеток простаты. При этом фильтрующий элемент на основе формата описан для культивирования и дифференцировки нормальных и злокачественных ОЦР простаты. дехвостатые описание процедур, необходимых для сбора клеток и обработки для иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного окрашивания предоставляются. Коллективно формат культура 3D описано в сочетании с первичными линиями CRC, обеспечивает важные средне- и высоко- пропускную способность системы для модели biospecimen на основе исследования простаты.
Introduction
Идентификация и использование методов лечения рака, которые являются персонифицированными для отдельных лиц являются основной целью в исследовании рака. В последнее время новые подходы были разработаны, которые позволяют большей легкостью в создании первичных клеточных культур, потенциально обеспечивая способы и определения и тестирования персонализированных терапии. Например, R-spondin основе простаты Органоид подход 1 позволяет для трехмерных (3D) культивирование нормальных и метастатических клеток рака простаты в коммерческом внеклеточного матрикса (например, Матригель), в то время как метод Кондиционно Перепрограммирование клеток (CRC) разработанный в Джорджтауне 2, 3 использует более стандартных условий 2D культуры. В частности, сочетание ингибитора киназы Rho (Y-27632) и облучают J2 мышиных фидерных клеток фибробластов приводит к неопределенному культивировании кератиноцитов контрольных сумм 2. Методология CRC являетсячрезвычайно прочный, с основными клеточные линии успешно установлены и сохраняться неопределенно долго от простаты и многих других нормальных и злокачественных эпителиальных тканей 3. Важно отметить, что наша CRC технология позволила для быстрой идентификации этиологической основы для рецидивирующего респираторного папилломатоза у пациента, который потерпел неудачу ряд предыдущих лекарственной терапии. Кроме того, с использованием нормальных и опухолевых полученных ЗПК, успешная идентификация FDA одобрило препарат, Vorinostat, было сделано в течение двух недель после биопсии исходной ткани. Пациент был помещен на вориностат, что привело к успешному лечению заболевания 4.
Нормальная предстательная железа состоит из люминала, базальных и редких клеток нейроэндокринных 5. Просветными клетки образуют столбчатую эпителиальный слой железы и выражают рецептора андрогена (AR), а также другие маркеры, такие его стенке, как цитокератинам 8 и 18 и просостояние-специфического антигена (ПСА) 6. С другой стороны , базальные клетки локализованы под слоем полостной и выразить цитокератин 5 и p63, но низкие уровни AR 5. Мы 7, 8, 9 и другие 10 успешно использовали ЗПК простаты в доклинических механистических исследований чувствительности к лекарственным препаратам. Тем не менее, при выращивании в стандартных условиях 2D культуры ткани, эти клетки не в полной мере участвовать AR сигнализации 10. Важно отметить, что при помещении под почечную капсулу иммунодефицитных мышей ЗПК восстановили нормальную простату железистой архитектуру и функции указывает, что ЗПК простаты сохраняют свою коммитирование при размещении в разрешительном среде. Разработка фильтрующего элемента на основе системы клеточной культуры , описанной здесь , позволяет быстро (2 недели) дифференциацию ин витро ОЦР простаты, о чем свидетельствует бу увеличение экспрессии генов-мишеней AR и AR, а также снижение уровня p63.
Фильтрующие вставки, используемые содержат поликарбонатные мембраны (размер пор 0,4 мкм), которые могут поддерживать культивирование клеток млекопитающих. Система, как развивается, использует нормальных и злокачественных ОЦР простаты, 6-луночные культуры и фильтрующих вставок. Среды для культивирования клеток , обусловленные клетками J2 11 помещают в нижнюю камеру и простаты дифференцирующих сред в верхней камере. Описанные здесь методы поддерживают люминальную простаты дифференцировки клеток в течение 2-х недельного срока, в соответствии с целями персонализированной медицины. Кроме того, было необходимо разработать методики, которые позволяют комплексной молекулярной, генетической и клеточной профилирования культур. Подходы для выделения ДНК, РНК и белка из клеток высвобождается с поверхности фильтра, были разработаны и обтекаемый для обработки образцов точной повтора. FinaLLY, методология, необходимые для удаления фильтра, чтобы включить вложение, секционирования и для H & E, иммуногистохимических и иммунофлуоресцентного окрашивания, полностью описан.
Protocol
Representative Results
Discussion
Первичные клеточные линии являются важной и быстро развивающейся платформой для исследований рака. Культура вставки на основе 3D-система культуры поддерживает дифференциацию первичных ОЦР простаты в течение двух недель сроки. Метод фильтра CRC представляет собой новый метод, средний п…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Т32 (CA 9686-18) и TL1 (TL1TR001431) постдокторский грантов обучение наград (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA), а также U01 PAR-12-095 (Kumar) и P30 CA051008-21 (Weiner). Пример фиксации, секционирования и окрашивание проводили в Lombardi Comprehensive Cancer Center гистологии и тканей совместно используемых ресурсов. Мы благодарим Ричарда Schlegel за полезные обсуждения. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института рака или Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
Referências
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Yuan, H., et al. Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).
- Signoretti, S., et al. p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).
- Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. Prostate cancer stem cells. J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).
- Ringer, L., et al. The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).
- Pollock, C. B., et al. Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).
- Crogliom, M., et al. Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair. Oncotarget. , (2016).
- Saeed, K., et al. Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer. Eur Urol. , (2016).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. J Vis Exp. (99), e52868 (2015).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
