En snabb Filterinsats-baserad 3D Culture System för primär prostatacelldifferentiering
Summary
Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.
Abstract
Villkorligt omprogrammerade celler (CRC) ger en hållbar metod för primär cellodling och förmågan att utveckla omfattande "levande biobanker" patient härledda cellinjer. För många typer av epitelceller, har olika tredimensionella (3D) odlingsmetoder beskrivits att stödja en förbättrad differentierat tillstånd. Medan CRC behåller sin härstamning engagemang för vävnad från vilken de isoleras, misslyckas de att uttrycka många av differentieringsmarkörer i samband med vävnaden ursprungs när den odlas under normala tvådimensionella (2D) odlingsbetingelser. Att förbättra tillämpningen av patientgenererade CRC för prostatacancerforskning, har en 3D-kultur-format har definierats som möjliggör en snabb (2 veckor totalt) luminala celldifferentiering i både normala och tumör härledda prostata epitelceller. Häri, är pt filterinsats-baserat format som beskrivits för odling och differentiering av både normala och maligna prostata CRC. En detailed beskrivning av de förfaranden som krävs för insamling cell och behandling för immunhistokemisk och immunofluorescerande färgning tillhandahålls. Kollektivt 3D kultur format som beskrivs i kombination med de primära CRC linjer, utgör ett viktigt medel- till hög genomströmning modellsystem för biospecimen baserad prostata forskning.
Introduction
Identifieringen och användning av cancerbehandlingar som är anpassade till individer är ett primärt mål inom cancerforskningen. På senare tid har nya metoder utvecklats som tillåter större lätthet i upprättandet av primära cellkulturer, potentiellt ger sätt både identifiera och testa personligt terapier. Till exempel, R-spondin baserade prostata organoid tillvägagångssätt 1 möjliggör tredimensionell (3D) odling av normala och metastatiska prostatacancerceller i en kommersiell extracellulär matrix (t.ex. Matrigel), medan Villkor Omprogrammering av celler metoden (CRC) utvecklats vid Georgetown 2, 3 använder mer standard 2D odlingsbetingelser. Bestämt kombinationen av en Rho-kinashämmare (Y-27632) och bestrålade J2 murina fibroblast-matarceller leder till den obestämda odling av keratinocytceller CRCs 2. CRC metoden ärextremt robust, med primära cellinjer framgångsrikt etablerat och underhålls på obestämd tid från prostatan och många andra normala och maligna epitelvävnader 3. Viktigt är vår CRC teknik möjliggjorde snabb identifiering av etiologiska grunden för återkommande andnings papillomatos hos en patient som hade misslyckats ett antal tidigare läkemedelsbehandlingar. Dessutom, med hjälp av normala och tumörhärledda CRC, framgångsrik identifiering av ett FDA-godkända läkemedel, vorinostat, gjordes inom två veckor efter första vävnadsbiopsi. Patienten placerades på vorinostat, vilket resulterar i den framgångsrika behandlingen av deras sjukdom 4.
Den normala prostatakörteln består av luminal, basal och de sällsynta neuroendokrina celler 5. Luminala celler bildar den kolonn epitelskikt av körteln och uttrycker androgenreceptorn (AR), såväl som andra luminala markörer såsom cytokeratiner 8 och 18 och prostate specifikt antigen (PSA) 6. Omvänt är basalceller lokaliserade under den luminala skiktet och uttrycker cytokeratin 5 och P63, men låga nivåer av AR 5. Vi 7, 8, 9 och andra 10 har framgångsrikt använt prostata CRC i prekliniska mekanistiska läkemedelskänslighet undersökningar. Men när den odlas under standard 2D vävnadsodlingsbetingelser, dessa celler misslyckas att fullt ut engagera AR signalering 10. Viktigt, när den placeras under njurkapseln i möss med immunbrist, den CRC återfick normal prostata körtel arkitektur och funktion tyder på att prostata CRC behåller sin härstamning engagemang när de placeras i en tillåtande miljö. Utvecklingen av filterinsatsen baserade cellkultursystem som beskrivs här gör det möjligt för den snabba (2 veckor) in vitro differentiering av prostata CRC vilket framgår by ökat uttryck av AR och AR målgener samt minskade nivåer av P63.
Filterinsatserna används innehåller polykarbonatmembran (porstorlek, 0,4 um) som kan stödja odling av däggdjursceller. Systemet, som utvecklats, använder sig av normala och maligna prostata CRC, 6 och odlingsskålar och filterinsatser. Cellodlingsmedia som betingas av J2 cellerna 11 är placerad i den nedre kammaren och prostata differen medier i den övre kammaren. De tekniker som beskrivs häri stödja prostata luminala celldifferentiering inom en 2 veckors tidsram, i linje med målen för personlig medicin. Det var också viktigt att utveckla metoder som gör det möjligt att omfattande molekylära, genetiska och cellulära profilering av kulturerna. Tillvägagångssätt för att isolera DNA, RNA och protein från celler som frigörs från filterytan har utvecklats och strömlinjeformad för noggrann upprepning urval bearbetning. Finally, den metod som krävs för att ta bort filtret för att möjliggöra inbäddning, snittning och för H & E, immunhistokemisk och immunofluorescerande färgning, beskrivs ingående.
Protocol
Representative Results
Discussion
Primära cellinjer är en viktig och snabbt växande plattform för cancerforskning. Odlingsinsatsen baserade 3D kultur Systemet stöder differentieringen av primära prostata CRC inom en två veckors tid. CRC filtermetoden representerar en ny, medel genomströmning metod för prostatacancer forskning. Befintliga mus PDX modeller är tidskrävande och extremt dyra, och många av de PDX proverna inte kan odlas i kultur, vilket begränsar läkarinitierad experiment och deras användbarhet. Dessutom medan andelen framgång…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av T32 (CA 9686-18) och TL1 (TL1TR001431) postdoktoral utbildning Beviljade bidrag (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) samt U01 PAR-12-095 (Kumar) och P30 CA051008-21 (Weiner). Prov fixering, sektionering och färgning utfördes i Lombardi Comprehensive Cancer Center histologi och Tissue delad resurs. Vi tackar Richard Schlegel för bra diskussioner. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Cancer Institute eller National Institutes of Health.
Materials
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
Referências
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Yuan, H., et al. Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).
- Signoretti, S., et al. p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).
- Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. Prostate cancer stem cells. J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).
- Ringer, L., et al. The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).
- Pollock, C. B., et al. Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).
- Crogliom, M., et al. Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair. Oncotarget. , (2016).
- Saeed, K., et al. Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer. Eur Urol. , (2016).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. J Vis Exp. (99), e52868 (2015).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
