Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.
Den konstruktiva biologi och syntetisk biologi tillvägagångssätt för att skapa artificiellt liv involverar bottom-up montering av biologiska eller icke-biologiska material. Sådana metoder har fått stor uppmärksamhet i forskning på gränsen mellan levande och icke-levande materia och har använts för att konstruera konstgjorda celler under de senaste två decennierna. I synnerhet, har Giant Blåsor (GVS) ofta använts som artificiella cellmembran. I detta dokument beskriver vi framställningen av GVS inkapslande mycket packade mikrosfärer som en modell av celler som innehåller mycket kondense biomolekyler. De GVS framställdes med hjälp av en enkel vatten-i-olja-emulsion centrifugeringsmetoden. Specifikt framställdes en homogenisator användes för att emulgera en vattenlösning innehållande de material som skall inkapslas och en olja innehållande upplösta fosfolipider, och den resulterande emulsionen skiktades försiktigt på ytan av en annan vattenlösning. Den skiktade systemet centrifugerades därefter to generera GVS. Denna kraftfulla metod användes för att inkapsla material, från små molekyler till mikrosfärer.
Den konstruktiva, eller syntetisk, biologi tillvägagångssätt är en fascinerande väg för att utforska gränsen mellan levande och icke-levande materia. Eftersom cellen är den minsta enhet som krävs för livet som vi förstår nu det, olika forskare har försökt att konstruera konstgjorda celler från enkla och väl förstått kemikalier så att fenomen som förekommer inom dessa konstgjorda celler kan studeras, med det yttersta målet att belysa livets uppkomst och studera de grundläggande funktionerna av levande celler 1, 2, 3. I synnerhet vesiklar 4, som är sfäriska microcompartments gjorda av amfifila molekyler och kan inkapsla biologiska molekyler såsom proteiner 5, 6 och DNA 7, 8, 9,lass = "xref"> 10, har ofta använts som modeller av biologiska membran.
Vesiklar kan klassificeras som små (definierad som har en diameter av <100 nm), stor (diameter <1 mm), eller jätte (diameter> 1 mm). Jätte vesiklar (GVS) har studerats ingående, eftersom de liknar levande celler i storlek, form och struktur. På grund av storleken av GVS, kan lätt observeras morfologiska förändringar i GV-membran i realtid under ett optiskt mikroskop.
Flera metoder för framställning av GVS har rapporterats 11, inklusive hydrering metoden 12, 13, den frysnings-upptiningsmetoden 14, den electroformation metoden 15, 16, och fluidic metod anordningen 17, 18. Emellertid inkapslande protein och annan MACROMolecules i GVS vid höga koncentrationer med hjälp av dessa metoder är svårt. I synnerhet, är det extremt svårt att inkapsla biologiska material i tillräcklig mängd (20-30 vol%) för att efterlikna det trånga miljön inuti cellerna 19, 20. Att bilda GVS direkt, Weitz och medarbetare etablerat en vatten-i-olja (w / o) -emulsion centrifugeringsmetoden 21, 22. Denna metod har fem viktiga funktioner. Först, eftersom GSV framställda enligt denna metod har låg lamellarity 23, 24, deras membran är så tunna att de kan deformeras lätt. GV-membran deformation inducerad av FtsZ (ett bakteriellt celldelning protein), tubulin och andra makromolekyler har studerats 25, 26, 27, 28, och vi observerade polyhe Dron liknande deformering av GV membran inducerade genom inkapsling av mikrosfärer 29, 30. För det andra, kan membranproteiner införas i vesikulär membran genom denna metod, om än med svårighet 31. Till exempel använde Yomo gruppen denna metod för att studera syntes in vitro och porbildande aktiviteten hos membranproteinet α-hemolysin 32. För det tredje är det möjligt att generera asymmetriska GVS där lipidkomponenterna hos de inre och yttre broschyrer är olika 22. Exempelvis Whittenton et al. genererade asymmetriska GVS med katjoniska lipider i inner broschyr att kapsla in negativt laddade polynukleotider, och med neutrala lipider på den yttre broschyr för att minska toxicitet och icke-specifik cellulärt upptag 33. För det fjärde kan koncentrationen och volymfraktionen av ämnen inne i GVS vara relativt högs = "xref"> 28, 34. För det femte kan flera olika typer av material inkapslas 35. Exempelvis Nishimura et al. inkapslade en in vitro transkription-translationssystem in i GVS och används systemet för att uttrycka grönfluorescerande protein (GFP) inom GVS 36. Dessa fem funktioner gör w / o-emulsion centrifuger en oumbärlig metod för att generera cellliknande GVS.
I tidigare arbete, var GSV genereras genom centrifugering uppsamlas med hjälp av en spruta försedd med en lång 16 G nål av rostfritt stål som innehåller en del av den slutliga vattenlösningen 22. I händerna på oerfarna tekniker, kan detta insamlingsmetod lätt leda till kontaminering av GV med en del av oljan. I denna studie använde vi w / o-emulsionen centrifuge protokoll som utvecklats av Yomo gruppen 23, 37,där utfällda GVS uppsamlas genom ett hål öppnat vid botten av centrifugröret i vilken de är beredda. Vi förberedde GVS inkapslande 1,0 | im mikrosfärer, som är ungefär lika stor som intracellulära organeller. Användningen av mikrosfärer tillät oss att uppskatta deras koncentration genom att beräkna sin volymandel. Fastställande av en metod för framställning av GVS i vilka material är tätt packade är ett viktigt steg för att skapa konstgjorda celler. För att bekräfta nyttan av våra protokoll för olika typer av inre material, visade vi också att GFP och en liten vattenlösligt fluorescerande molekyl (uranine) kan inkapslas i GVS.
De specifika vikterna för den inre vatten dispersionsmediet och den yttre vattenlösningen måste väljas noggrant. För v / o-emulsionen för att fälla in i den yttre vattenlösningen under centrifugeringen, måste den specifika vikten för den inre vatten dispersionsmediet vara större än den för den yttre vattenlösning. Vi försökte förbereda GVS använder inre och yttre lösningar utan socker, men vi fick inga GVS under dessa förhållanden, eftersom den inre vattenlösning inte har tillräckligt med massa för att korsa interferens mellan de två faserna. Om det finns en stor osmotisk tryckskillnad mellan de två lösningarna, GVS som faller ut i den yttre vattenlösningen kan krympa eller bristning. Därför måste det osmotiska trycket inuti och utanför de GVS vara lika. För att åstadkomma detta använde vi sackaros som ett löst ämne i den inre vattenhaltiga dispersionen och glukos som ett löst ämne i den yttre vattenlösning; både socker var vid samma koncentration. både saltss = "xref"> 22 och socker 23, 35, 38 har använts för sådana ändamål, men socker används vanligen eftersom det är mindre giftiga och mer lösligt än salt. Men om för mycket socker tillsättes, kan de GVS komma i kontakt med botten på täckglaset och kollaps. Det finns flera strategier för att undvika detta. En strategi är att reducera den specifika vikten skillnaden mellan de inre och yttre vattenlösningar så att de GVS faller ut under milda betingelser; specifikt kan supernatanten av det utfällda GV dispersionen utbytas med en lösning som är identisk med den inre vattenlösning för att minska risken för vesikulär bristning genom vidhäftning till täckglaset på grund av flytkraft. En annan strategi är att förbelägga båda av täckglas med en tunn lipidfilm 29.
Korrekt beredning och inkubation av emulsionenViktigt. Vi använde flytande paraffin för att framställa oljelösningen. Mineralolja 26, 31, dodekan 21, 33, och skvalan 33, är 39 också ofta används som lösningsoljor. Eftersom dessa material varierar i specifik vikt, viskositet och ytspänning, olika antal vesiklar bildas även när samma centrifugeringsbetingelser används 33. För erhållande av de vesiklar med målgrupp egenskaper, är det viktigt att optimera de specifika vikter och viskositeter hos de inre och yttre vattenlösningar samt centrifugal acceleration.For framställning av oljefasen, måste inkubering ske vid hög temperatur och i en torr miljö såsom en kuvös eller en dehydrator. I denna studie, upphettades vi den flytande paraffin till 80 ° C för att fullständigt upplösa fett molecules.In Dessutom emulsionen börendast framställas efter behov och bör omedelbart utsattes för centrifugering, därför att den är instabil precis efter att det framställs och w / o-dropparna lätt smälta till varandra. Emulsionen kan framställas i stora mängder genom ultraljudsbehandling, virvel eller avlyssning. Dock, med användning av en homogenisator tillåter snabb framställning av stora mängder av emulsionen och lättare emulgering i olja med en hög viskositet. Det är också viktigt att emulsionen vara skiktade på den yttre vattenlösningen försiktigt och snabbt och kyldes därefter vid 4 ° C. Att förkorta tiden mellan emulgering och centrifugering, kan den olje yttre vattenlösning systemet förkyld innan emulsionen skiktas på den, och hela systemet kan därefter centrifugeras immediately.If den vita grumlas snabbare eller långsammare än vanligt, den mekaniska homogenisator måste sköljas noggrant för att ta bort rengöringsmedel. Dessutom, före emulgering, måste oljelösningen, inre vattenlösning, och emulgeringsmedel vara returned till rumstemperatur.
Korrekt centrifugalkraften är också viktigt. Genom centrifugering vid 18.000 x g, kunde vi förbereda GVS med en enda inre material inkapslat i en hög koncentration. När det krävs inkapsling av flera material, är det bättre att reducera centrifugalkraften. Till exempel framställdes en aktinsammansättning systemet inkapslande sju föreningar uppnås med centrifugering vid mindre än 350 x g 35. I sådana fall där centrifugering inte är önskvärt, kan GSV erhållas genom justering av koncentrationen av socker eller genom utfällning av emulsionen under inverkan av sin egen massa 38, 40, 41.
Den metod som rapporteras häri har två stora begränsningar. Den ena är att oljemolekyler (paraffin, i det här fallet) kan löses i GV membran, som har påpekats av Weitz grupp 21. När införingen av ett membranprotein in i GV membranet önskas, måste effekterna av samexisterande olja molekyler på proteinet övervägas. Den andra begränsningen är den variation av volymfraktionen. I denna studie uppskattade vi att halterna av mikrosfärer i GVS varierade från 4 till 30 vol%; halterna inte var identisk med den volymandel av den inre vattenlösning som används för GV beredning. Även om vi skulle kunna inkapsla mikrosfärer i de GVS vid en volymfraktion tillräckligt hög för mikroskopi observation, är denna metod inte lämplig för framställning av GVS med en likformig volymfraktion fördelning. Det har rapporterats att fördelningen av mikrosfärvolymfraktioner förändras under centrifugering 34.
W / o-emulsion centrifugeringsmetoden används ofta för bildandet av GVS innehåller inkapslade material. Dock har några rapporter beskrivit preparation av GVS inkapslande mikroskala material 34, 42. På senare tid har molekylära robotar som innehåller en inkapslad DNA-enhet eller en molekylär enhet byggts 43, 44. GVS med facken är det första valet för dessa typer av applikationer; därför kan tekniker, såsom vårt, som skulle kunna användas för inkapsling av magnetiska mikrosfärer och mikrosfärer med olika ytfunktionalisering förväntas vara användbar 44.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Tomoko Yamaguchi för att rita den schematiska bilden i figur 1. Denna studie stöddes av Okazaki ORION Project i Okazaki institutet för integrativ Bioscience av theNational institut för naturvetenskap (NINS); av Astrobiology Center Project (inget AB281010.) av NINS; genom en Grant-i-Stöd för vetenskaplig forskning om innovativa områden (Dynamisk beställning av biomolekylära system för att skapa integrerade funktioner) från Japan Society för främjande av Science (JSPS) (ingen 25.102.008.); genom en Grant-i-Stöd för unga forskare (B) (till KK, ingen 15K17850.) från JSPS; andby en Grant-i-Stöd för forskningsverksamheten Start-Up (till YN, nej. 15H06653) från JSPS. Ytterligare stöd kom från ett bidrag från Noguchi Institute, ett bidrag från Kao Stiftelsen för Arts and Sciences, och ett bidrag från Kurita Water and Environment Foundation.
REAGENTS: | |||
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
Liquid paraffin | Wako Pure Chemical Industries | 128-04375 | Oil, Density (20℃) 0.86 -0.89 g/mL |
1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT: | |||
Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy micro-homogenizer |
Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470-495 nm Emission filter: 510-550 nm |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565–585 nm Emission filter: 600-690 nm |