Identifikasjon av Plasmodesmal lokalisering sekvenser i proteiner i Planta
Summary
Anlegget intercellulære tilkoblinger, plasmodesmata (Pd), spille sentrale roller i anlegget fysiologi og plante-virus interaksjoner. Kritisk til Pd transport sorterer signaler som direkte proteiner til Pd. Vår kunnskap om disse sekvensene er imidlertid fortsatt i sin barndom. Vi beskriver en strategi for å identifisere Pd lokalisering signaler i Pd-målrettet proteiner.
Abstract
Plasmodesmata (Pd) er celle til celle tilkoblinger som fungerer som inngangsporter gjennom små og store molekyler transporteres mellom anlegget celler. Mens Pd transport av små molekyler, som ioner og vann, antas å oppstå passivt, celle-til-celle transport av biologiske makromolekyler, slik proteiner, sannsynligvis skjer via en aktiv mekanisme som involverer målretting sender på den transporteres molekylet. Knapphet på identifiserte plasmodesmata (Pd) lokalisering signaler (PLSs) har sterkt begrenset forståelse av protein-sortering trasé involvert i plante celle til celle macromolecular transport og kommunikasjon. Fra et vell av endogene og virale proteiner kjent trafikk gjennom Pd, bare tre PLSs er rapportert til dags dato, alle av dem fra endogene anlegget proteiner. Det er derfor viktig å utvikle en pålitelig og systematisk eksperimentelle strategi for å identifisere en funksjonell PLS sekvens, som er både nødvendig og tilstrekkelig for Pd målretting, direkte i levende anlegget celler. Her beskriver vi en slik strategi med som et paradigme celle til celle bevegelse protein (MP) av tobakk mosaikk virus (TMV). Disse eksperimentene, som identifisert og preget første anlegget viral PLS, kan tilpasses for oppdagelse av PLS sekvenser i mest Pd målrettede proteiner.
Introduction
Plasmodesmata (Pd) fungere som kanaler for intercellulære transport av viktige regulatorer anlegget og morphogenesis, alt fra transkripsjonsfaktorer mRNA og små RNA molekyler. Videre er benyttes denne macromolecular kapasitet av Pd av de fleste plante virus for deres intercellulære spredning under infeksjon; Hvis du vil flytte Pd, har plante virus utviklet spesialiserte proteiner, kalt bevegelse proteiner (MPs), som spesifikt mål Pd1,2,3,4,5,6 , 7. molekylær veier av Pd transport sannsynligvis er nært sammen med bestemte sekvensene som mål transportert proteiner i disse veiene. Identifikasjon av disse Pd lokalisering signaler (PLSs) kan dermed være diagnostiske av den tilsvarende Pd transport veien. Dette er ved analogi Pd transport8, for eksempel å forskjellige kjernefysiske import trasé, som kan være spesifikke for ulike kjernefysiske lokalisering signal (NLS) sekvenser9,10. Konseptuelt, representerer både NLSs og PLSs ikke-cleavable subcellular målretting sekvenser som er nødvendig og tilstrekkelig for målretting. Men i motsetning til NLSs11er sekvens informasjon om PLSs sterkt begrenset. Spesielt, er bare fire protein sekvenser involvert i Pd målretting rapportert, med alle av dem fra endogene anlegget proteiner. Den første som representeres av et homeobox-domene KN112 -en transkripsjon faktor som flytter fra indre lag til overhuden anlegg blad13 -og dens KNOX homologs14. Andre er også fra en transkripsjon faktor, Dof, som inneholder en antatte PLS beskrevet som intercellulære smugling (IT) motiv15. Den tredje sekvensen er fra PDLP1 plasmodesmata-bolig type 1 membran protein, og det er representert ved en transmembrane domene16. Til slutt, fjerde Pd målretting sekvensen ble nylig rapportert for glycosylphosphatidylinositol (GPI)-forankret proteiner og det er representert ved glycosylphosphatidylinositol (GPI) endring signal17.
Interessant, har ingen PLSs inntil ganske nylig, er rapportert for viral MPs. Tidligere studier angitt tilstedeværelsen av antatte PLS sekvenser i anlegget viral MPs18,19, men ingen sanne PLS, dvsen minimal aminosyresekvens både nødvendig og tilstrekkelig for Pd målretting av en urelaterte Last molekyl ( f.eks., CFP) har blitt identifisert i en viral MP. Enda var en av disse proteinene, MP av tobakk mosaikk virus (TMV), først som Pd lokalisering og transport har vært demonstrert20.
For å dekke dette gapet, utviklet vi en eksperimentell strategi for å identifisere TMV MP PLS. Denne strategien var basert på tre konsepter. (i) vi definert PLS som en minimal aminosyresekvens som er både nødvendig og tilstrekkelig for protein målretting til Pd21. (ii) fordi TMV MP først mål Pd og deretter translocates gjennom disse kanalene22, rettet vi mot uncoupling disse to aktivitetene og identifisere bona fide PLS, som fungerer bare for Pd målretting, og ikke for påfølgende transport. (iii) vi analysert de identifiserte PLS for aminosyre rester viktig for sin Pd målretting aktivitet, enten strukturelt eller funksjonelt. Bruker denne tilnærmingen, avgrenset vi en 50-amino acid rester sekvens på amino-terminus av TMV MP som fungerer som bona fide PLS. Dette ble gjort ved å produsere en rekke TMV MP fragmenter som mettet hele lengden av protein, merking deres carboxyl-termini med CFP og transiently uttrykker dem i anlegget vev. PD lokalisering av testet fragmenter ble bestemt av coexpressing dem med en Pd markør protein, PDCB1 (Pd callose binding protein 1)23. Minste fragmentet som fortsatt lokalisert til Pd, men ikke går Pd, ble ansett som representerer PLS. Endelig var PLS alanin skannet å finne viktig aminosyre rester kreves for sin struktur og funksjon.
Mens her vi illustrere denne tilnærmingen ved å beskrive identifikasjon av TMV MP PLS, kan det brukes å oppdage PLSs i noen andre Pd-målrettet proteiner, om kodet av plante-patogener eller planter selv; Dette er fordi vår metode ikke dra nytte av viral MPs med hensyn til deres evne til å målrette unike funksjoner Pd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen har fire core bestanddeler: begrepet identifisere en sekvens som er både nødvendig og tilstrekkelig for målretting for Pd, systematisk arbeidsdeling protein av interesse i fragmenter som gradvis reduseres i lengde, blander den testet fragmenter til en autofluorescent protein som tjener både som koden og macromolecular Last og funksjonelle analysen for Pd målretting i levende plante vev etter forbigående uttrykk for testet fusion proteiner. Merk at Agrobacterium-mediert forbigående uttrykk generer…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi sitert det meste oversiktsartikler av mangel på plass, og vi beklager til våre kolleger som originale arbeider ikke ble nevnt. Arbeidet i V.C. laboratorium støttes av tilskudd fra NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD og BSF til V.C. og delefilter laboratoriet støttes av NIH og midler fra avdelinger av anlegget patologi og plante-mikrobe biologi til delefilter
Materials
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) | Zeiss | LSM5 | Any CLSM with similar capabilities is appropriate |
| Zen software for confocal microscope imaging | Zeiss | 2009 version | The software should be compatible with the CLSM used |
| Quickchange II site-directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES | Sigma-Aldrich | 69892 | |
| Syringes without needles | BD | 309659 | |
| MgCl2 | FisherScientific | M33-500 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 |
Referências
- Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
- Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
- Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. Intercellular communication via plasmodesmata. New Phytol. 205, 970-972 (2015).
- Jackson, D. Plasmodesmata spread their influence. F1000Prime Rep. 7, 25 (2015).
- Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
- Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44 (2014).
- Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
- Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport?. BioEssays. 22, 532-544 (2000).
- Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
- Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
- Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
- Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
- Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
- Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355 (2014).
- Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
- Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7 (2008).
- Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
- Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
- Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
- Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
- Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
- Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
- Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
- Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
- Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
- Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
- Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15 (3), 219-235 (1997).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42 (3D), 1-7 (2016).
- Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. , 101-108 (1997).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
- Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
- Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
- Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
- Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
- Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
- Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
- Ausubel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
- Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
- Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
- Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
- Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).
