संयंत्र आइस recrystallization निषेध और अलगाव के मूल्यांकन के माध्यम से बर्फ बाध्यकारी प्रोटीन आइस आत्मीयता शोधन का उपयोग करते हुए की पहचान
Summary
यह पत्र बर्फ-पुनर्संरचना निरोधक गतिविधि के आकलन के माध्यम से फ्रीज-सहिष्णु पौधों से बर्फ बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान और बर्फ-आत्मीयता शुद्धि का उपयोग करके देशी आईबीपी के बाद अलगाव की रूपरेखा है।
Abstract
आइस बंधनकारी प्रोटीन (आईबीपीएस) तनाव प्रेरित प्रोटीन कि सबजीरो तापमान के संपर्क में कुछ जीवों द्वारा संश्लेषित कर रहे हैं के एक परिवार के हैं। पौधों में, फ्रीज क्षति होती है जब बाह्य बर्फ के क्रिस्टल बड़े होते हैं, प्लाज्मा झिल्ली और संभव कोशिका मृत्यु का टूटना में जिसके परिणामस्वरूप। बर्फ के क्रिस्टल करने के लिए आईबीपीएस की सोखना, बर्फ recrystallization निषेध (IRI) के रूप में जाना जिससे सेलुलर क्षति को कम करने के लिए एक प्रक्रिया से आगे के विकास को प्रतिबंधित करता है। आईबीपीएस भी संतुलन पिघल बिंदु से नीचे एक समाधान, एक संपत्ति थर्मल हिस्टैरिसीस (वें) गतिविधि के रूप में जाना जाता है का हिमांक दबाना करने की क्षमता का प्रदर्शन। इन सुरक्षात्मक गुण, औद्योगिक चिकित्सा और कृषि अनुप्रयोगों में अपनी क्षमता उपयोग के कारण उपन्यास आईबीपीएस की पहचान करने में दिलचस्पी बढ़ गई है। इस पत्र के माध्यम से 1 संयंत्र आईबीपीएस की पहचान) संयंत्र के ऊतकों में प्रेरण और निष्कर्षण आईबीपीएस की, 2) IRI गतिविधि के लिए अर्क की स्क्रीनिंग, और 3) अलगाव और purif का वर्णन करता हैआईबीपी की जानकारी निम्न तापमान के जोखिम से आईबीपी की प्रेरण के बाद, एक 'स्प्लैट परख' का उपयोग करके आईआरआई गतिविधि के लिए निष्कर्षों का परीक्षण किया जाता है, जो एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके बर्फ के क्रिस्टल वृद्धि का अवलोकन करने की अनुमति देता है। इस परख को कम प्रोटीन एकाग्रता की आवश्यकता होती है और ऐसे परिणाम उत्पन्न होते हैं जो जल्दी से प्राप्त होते हैं और आसानी से व्याख्या करते हैं, बर्फ बाध्यकारी गतिविधि के लिए प्रारंभिक स्क्रीन प्रदान करते हैं। आईबीपी को फिर से आईबीपी की संपत्ति का उपयोग करके बर्फ को एक्सोर्ब करने के लिए प्रोटीन्स दूषित होने से अलग किया जा सकता है, जिसे 'आइस-एफ़िनिटी शुद्धि' नामक एक तकनीक के माध्यम से अलग किया जा सकता है। संयंत्र निष्कर्षों से एकत्र सेल lysates का उपयोग करते हुए, एक बर्फ गोलार्द्ध धीरे धीरे एक पीतल जांच पर उगाया जा सकता है। इसमें आईबीपी को पॉलीक्रिस्टेलिन बर्फ के क्रिस्टलीय संरचना में शामिल किया गया है। आईबीपी के किसी पूर्वोक्त जैव रासायनिक या संरचनात्मक ज्ञान की आवश्यकता नहीं है, इस पद्धति से सक्रिय प्रोटीन की वसूली की अनुमति मिलती है आइस-शुद्ध प्रोटीन अंशों का इस्तेमाल डाउनस्ट्रीम एप्लीकेशंस के लिए किया जा सकता है जिसमें पीप की पहचान भी शामिल हैमास स्पेक्ट्रोमेट्री और देशी प्रोटीन की जैव रासायनिक विश्लेषण द्वारा ज्वार दृश्यों।
Introduction
आइस बंधनकारी प्रोटीन (आईबीपीएस) सुरक्षात्मक प्रोटीन है कि पौधों 1, कीड़े 2, मछली 3, और रोगाणुओं 4 सहित जीवों की संख्या में खोज की गई है की एक विविध परिवार हैं। इन प्रोटीनों की प्रमुख विशेषता उनके अद्वितीय विशेष रूप से और कुशलता से, बर्फ के क्रिस्टल के अधिशोषण के लिए उनके विकास को संशोधित करने की क्षमता है। आईबीपीएस, कई दस्तावेज गुण होते हैं दो सबसे अच्छी तरह से किया जा रहा है की विशेषता थर्मल हिस्टैरिसीस (वें) और बर्फ recrystallization निषेध (IRI) के साथ। वें गतिविधि और अधिक आसानी से फ्रीज असहिष्णु पशुओं में उत्पादित आईबीपीएस में मनाया जाता है। इस गतिविधि में ठंड को रोकने के लिए जीवों की संचार या मध्यवर्ती तरल पदार्थों का हिमांक को कम करने में परिणाम नहीं। इसके विपरीत, फ्रीज सहिष्णु जीवों, जो अनिवार्य रूप से सबजीरो तापमान पर फ्रीज होगा, आईबीपीएस कम वें गतिविधि दिखाई देते हैं। कम वें गतिविधि के बावजूद, एक उच्च IRI गतिविधि बर्फ रोना प्रतिबंधित करने के लिएstal विकास अक्सर इन प्रोटीनों के साथ मनाया जाता है। फ्रीज सहिष्णु जीव के लिए, यह IRI गतिविधि शायद बाह्य डिब्बों में बर्फ की अनियंत्रित वृद्धि से कोशिकाओं की रक्षा में मदद करता है।
"गद्दा बटन" मॉडल व्यवस्था है जिसके द्वारा आईबीपीएस बर्फ के क्रिस्टल 5 के विकास को रोकने का वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस मॉडल के तहत, आईबीपीएस विशेष रूप से अंतराल, ऐसी है कि पानी के अणुओं केवल बाध्य आईबीपीएस के बीच की जगह में बढ़ती बर्फ क्रिस्टल जालक के साथ शामिल कर सकते हैं पर बर्फ क्रिस्टल की सतह के लिए अधिशोषण। यह एक वक्रता है कि अतिरिक्त पानी के अणुओं का समावेश प्रतिकूल बना देता है, एक घटना गिब्स-थॉमसन प्रभाव 6 से वर्णित किया जा सकता है कि पैदा करता है। लंगर clathrate पानी परिकल्पना बर्फ क्रिस्टल की सतह के लिए आईबीपीएस के विशिष्ट बंधन के लिए एक तंत्र उपलब्ध कराता है जिसके आरोप लगाया अवशेषों की उपस्थिति, विशेष रूप से प्रोटीन बर्फ बाध्यकारी साइट पर तैनात, REO में परिणामपानी के अणुओं की rganization तो वे बर्फ क्रिस्टल जालक 7 में से एक या एक से अधिक विमानों से मेल खाते हैं।
वें गतिविधि पिघलने के बीच अंतर को मापने और एक आईबीपी की उपस्थिति में ठंड एक भी बर्फ क्रिस्टल के तापमान मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। जबकि वें गतिविधि आईबीपीएस, कम वें खाई संयंत्र आईबीपीएस (आमतौर पर केवल एक डिग्री का एक अंश) द्वारा उत्पादित की गतिविधि मूल्यांकन का एक व्यापक रूप से स्वीकार विधि है सामान्य रूप से एक उच्च प्रोटीन एकाग्रता, विशेष उपकरणों और ऑपरेटर अनुभव की आवश्यकता है। हालांकि गैर आईबीपीएस बर्फ क्रिस्टल विकास को सीमित कर सकते हैं, यह एक संपत्ति सब आईबीपीएस और इस तरह IRI गतिविधि के लिए परीक्षण द्वारा साझा किया जाता है आईबीपीएस की उपस्थिति के लिए एक प्रभावी प्रारंभिक स्क्रीन, विशेष रूप से कम वें गतिविधि के साथ उन लोगों के लिए है। इस गतिविधि का परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता कार्यप्रणाली एक 'सूचक परख', जिसके तहत एक प्रोटीन नमूना फ़्लैश छोटे बर्फ के क्रिस्टल, जो अगर निर्धारित करने के लिए समय की अवधि में मनाया जाता है की एक monolayer निर्माण करने के लिए जमे हुए है के रूप में जाना जाता हैबर्फ क्रिस्टल विकास प्रतिबंधित है। आईबीपीएस की उपस्थिति के लिए एक स्रोत ऊतक का नमूना स्क्रीन करने के लिए प्रयोग किया जाता है अन्य तरीकों के विपरीत, इस तकनीक 10-100 एनजी की सीमा में कम प्रोटीन सांद्रता के लिए लागू है, आसानी से मनगढ़ंत उपकरण का इस्तेमाल करता है, और है कि जल्दी और आसानी से व्याख्या डेटा उत्पन्न करता है। हालांकि, यह तनाव है कि इस परख आईबीपीएस कि वें के निर्धारण और बर्फ क्रिस्टल को आकार देने के द्वारा पालन किया जाना चाहिए के लिए एक प्रारंभिक स्क्रीन प्रदान करता है महत्वपूर्ण है।
देशी प्रोटीन का अलगाव चुनौती दे रहा है, अक्सर ब्याज की एक प्रोटीन के संरचनात्मक और जैव रासायनिक गुणों के बारे में जानकारी की आवश्यकता होती है। बर्फ के लिए आईबीपीएस की आत्मीयता इन शुद्धि प्रयोजनों के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में बर्फ का उपयोग कर प्रोटीन की अलगाव के लिए अनुमति देता है। के बाद से अणुओं के बहुमत बर्फ क्रिस्टल विकास, एक उच्च शुद्ध नमूने में एक आईबीपी नमूना परिणामों की उपस्थिति में एक आइस-गोलार्द्ध की धीमी वृद्धि, बड़े quantit से रहित दौरान बर्फ का पानी सीमा से आगे धकेल दिया जाता हैप्रोटीन और विलेय contaminating की एँ। इस विधि कीड़े 8, 9, 10, बैक्टीरिया 11, मछली 12 और पौधों 13, 14 से आईबीपीएस की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया है। साथ ही, आईबीपी-समृद्ध इस पद्धति के माध्यम से प्राप्त अंशों भी नीचे की ओर जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। इस पत्र प्रेरण और आईबीपीएस की निकासी के माध्यम से पौधों में आईबीपीएस की पहचान की रूपरेखा, IRI गतिविधि का विश्लेषण प्रोटीन की उपस्थिति, और बर्फ आत्मीयता शुद्धि का उपयोग कर प्रोटीन के अलगाव की पुष्टि के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
सफल विश्लेषण और आईबीपीएस की शुद्धि के लिए, यह इन प्रोटीनों में से कुछ के तापमान के प्रति संवेदनशील प्रकृति को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। कुछ संयंत्र आईबीपीएस ऊपर 0 डिग्री सेल्सियस तापमान पर अस्थिर हो,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए एक VKW NSERC (कनाडा) अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/ camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
Referências
- Sidebottom, C., et al. Heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256 (2000).
- Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
- Davies, P. L., Hew, C. L. Biochemistry of fish antifreeze proteins. FASEB J. 4 (8), 2460-2468 (1990).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).
- Yeh, Y., Feeney, R. E. Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function. Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).
- Smolin, N., Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).
- Graham, L. A., Davies, P. L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas. Science. 310 (5747), 461 (2005).
- Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova. J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).
- Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity. PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).
- Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L. Hyperactive antifreeze protein in a fish. Nature. 429 (6988), 153 (2004).
- Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants. Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).
- Gupta, R., Dreswal, R. Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant. Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).
- Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice. Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).
- Middleton, A. J., et al. Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants. Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).
- Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. J. , (2016).
- Olijve, L. L., et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).
- Zakharov, B., et al. Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study. J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).
- Capicciotti, C. J., et al. Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations. Sci. Rep. 5, 9692 (2015).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues. Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).
- Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L. Ice-shell purification of ice-binding proteins. Cryobiology. 72 (3), 258-263 (2016).
- Basu, K., et al. Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).
- Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses. BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
