Identifisering av Plant is-bindende proteiner ved å bedømme is-rekrystallisasjon inhibering og isolering ved bruk av is-affinitetsrensing

Summary

Dette dokumentet beskriver identifikasjon av is-bindende proteiner fra fryse-tolerante planter gjennom vurdering av is-rekrystallisasjon inhiberende aktivitet og påfølgende isolering av naturlige aktørene kan ved hjelp av is-affinitetsrensing.

Abstract

Ice-bindende proteiner (uavhengige aktører) tilhører en familie av stress-induserte proteiner som syntetiseres av visse organismer som utsettes for temperaturer under frysepunktet. I planter, oppstår frostskader når ekstracellulære iskrystaller vokser, noe som resulterer i brudd på plasmamembraner og mulig celledød. Adsorpsjon av aktørene kan til iskrystaller begrenser videre vekst ved en prosess som er kjent som is omkrystallisering inhibering (IRI), for derved å redusere cellulær skade. Aktørene kan også vise evne til å nedsette frysepunktet av en løsning under likevektssmeltepunkt, en egenskap som er kjent som termisk hysterese (TH) aktivitet. Disse beskyttende egenskaper har hevet interesse i identifikasjon av nye aktørene kan på grunn av deres potensielle anvendelse i industri, medisin og jordbruksanvendelser. Dette dokumentet beskriver identifisering av plante aktørene kan gjennom 1) innløps- og utvinning av aktørene kan i plantevevet, 2) screening av ekstrakter for IRI aktivitet, og 3) isolering og opprensetication av globale kjernenettgrossistene. Etter induksjon av aktørene kan ved lav temperatur eksponering, blir ekstrakter testet for IRI-aktivitet ved anvendelse av en 'feilindikator assay', som muliggjør observasjon av is krystallvekst ved hjelp av et standard lysmikroskop. Denne analysen krever en lav proteinkonsentrasjon og frembringer resultater som er oppnådd raskt og enkelt tolket, og gir en første skjerm for is bindingsaktivitet. Aktørene kan kan så bli isolert fra forurensende proteiner ved å utnytte den egenskap uavhengige aktører å adsorbere til is, gjennom en teknikk som kalles 'is-affinitetsrensing'. Ved hjelp av cellelysater som er samlet fra planteekstrakter, kan en is halvkule langsomt dyrkes på en messing sonde. Dette gjelder blant uavhengige aktører i den krystallinske struktur av den polykrystallinske is. Krever noen a priori biokjemisk eller strukturell kjennskap til IBP, gir denne metode for utvinning av aktivt protein. Ice-rensede proteinfraksjoner kan brukes til nedstrøms applikasjoner inkludert identifikasjon av peptidevanns sekvenser ved massespektrometri og biokjemisk analyse av native proteiner.

Introduction

Ice-bindende proteiner (uavhengige aktører) er en sammensatt familie av beskyttende proteiner som har blitt oppdaget i en rekke organismer, inkludert planter, insekter ^{1 2, 3,} fisk og mikrober ^4. Den viktigste funksjonen til disse proteinene er deres enestående evne til spesifikt og effektivt adsorbere til iskrystaller, modifisere deres vekst. Aktørene kan ha flere dokumentegenskaper, sammen med de to mest godt karakterisert, er termisk hysterese (TH) og is-omkrystallisering inhibering (IRI). TH aktivitet er mer lett observeres i aktørene kan produseres i fryse-intolerant dyr. Denne aktivitet resulterer i en senkning av frysepunktet til organismenes sirkulasjons eller interstitielle væsker for å hindre frysing. I motsetning til dette, i fryse-tolerant organismer, som uunngåelig vil fryse ved temperaturer under frysepunktet, aktørene kan synes å ha lav TH aktivitet. Til tross for den lave TH aktivitet, til en høy aktivitet IRI begrense iskryststal vekst er ofte observert med disse proteiner. For fryse-tolerant organisme, dette IRI aktiviteten antagelig bidrar til å beskytte cellene mot ukontrollert vekst av is i ekstracellulære rom.

Den "madrass knapp" modellen kan brukes til å beskrive mekanismen som aktørene kan hindre vekst av iskrystaller ^5. Under denne modellen, aktørene kan spesifikt å adsorbere til den iskrystall overflate i intervaller, slik at vannmolekylene kan bare innlemme med økende is krystallgitteret i rommet mellom bundne uavhengige aktører. Dette skaper en krumning som gjør inkorporering av ytterligere vannmolekyler ugunstig, en hendelse som kan beskrives ved den Gibbs-Thomson-effekt ^6. Det forankrede innesluttede vann hypotese gir en mekanisme for den spesifikke binding av aktørene kan til is krystalloverflaten, hvorved tilstedeværelsen av ladede rester, spesielt plassert på proteinet is bindingssetet, resulterer i den reorganization av vannmolekylene slik at de samsvarer med ett eller flere plan over is krystallgitteret ^7.

TH aktivitet kan kvantifiseres ved å måle forskjellen mellom smelte og minusgrader i et enkelt iskrystaller i nærvær av en IBP. Mens TH aktivitet er en bredt akseptert metode for å vurdere aktiviteten av aktørene kan den lave TH gapet produsert ved anlegget uavhengige aktører (vanligvis bare en brøkdel av en grad) som normalt krever en høy proteinkonsentrasjon, spesialutstyr og operatørerfaring. Selv om det ikke kan uavhengige aktører begrense is krystallvekst, er det en egenskap som deles av alle aktørene kan og således teste for IRI-aktivitet er effektiv initial skjerm for tilstedeværelse av aktørene kan, spesielt for de med lav TH aktivitet. Den metodikk som brukes til å teste denne aktivitet er kjent som en 'feilindikator assay', hvorved en proteinprøve blir flash-frosset for å produsere et monolag av små iskrystaller, som observeres i løpet av en periode for å avgjøre omIskrystallvekst er begrenset. I motsetning til andre metoder som brukes til å skjerme en kildevevsprøve for nærvær av IBP, er denne teknikken anvendelig for lavproteinkonsentrasjoner i området 10-100 ng, benytter lettfabrikkert utstyr og genererer data som raskt og enkelt tolkes. Imidlertid er det viktig å understreke at denne analysen gir en innledende skjerm for IBPer som bør følges av bestemmelsen av TH og iskrystallforming.

Isoleringen av native proteiner er utfordrende, og krever ofte informasjon om de strukturelle og biokjemiske egenskapene til et protein av interesse. Affiniteten til IBPer for is muliggjør isolering av disse proteinene ved anvendelse av is som et substrat for rensningsformål. Siden flertallet av molekyler skyves foran isvannsgrensen under iskrystallvekst, resulterer langsom vekst av en iskule i nærvær av en IBP-prøve i en høyt renet prøve, uten stor kvantitettallet av kontaminerende proteiner og oppløste stoffer. Denne metoden har blitt anvendt for å identifisere aktørene kan fra insekter ^{8, 9, 10, 11} bakterier, fisk ¹² og anleggene ^{13, 14.} I tillegg kan de IBP-anrikede fraksjoner som er oppnådd gjennom denne fremgangsmåten også bli brukt til nedstrøms biokjemisk analyse. Dette dokumentet beskriver identifiseringen av aktørene kan i planter gjennom induksjon og utvinning av uavhengige aktører, til analyse av IRI-aktivitet bekrefter tilstedeværelse av proteiner, og isolering av proteiner ved anvendelse av is affinitetsrensing.

Protocol

1. Sprut Apparat oppsett Fyll en temperatur-programmerbar sirkulerende vannbad med etylenglykol (50% v / v i vann). MERK: Grønn automotive etylenglykol kan brukes. For å montere den ytre kammeret, bruk isolert plastrør for å feste vannbad til en dobbeltvegget glassbolle. Isoler glassbollen med polystyrenskum og dekk med en petriskål av plast lokk. Skjær en 3-4 tommers hull i bunnen av polystyren-kammeret, slik at lyskilden kan sees gjennom den glasskammer. Monter ytre kammer p…

Representative Results

For enkel oppsett, figur 1 og Figur 2 er inkludert som visuelle representasjoner av det utstyr som brukes for IRI analyse og is-affinitetsrensing, henholdsvis. Resultater av analyse ved hjelp av IRI-ekstrakter samles inn fra sennep luke med og uten uavhengige aktører er avbildet i figur 3. Disse resultatene viser at ekstrakter samlet inn fra sennep luke, som ikke er fryse-toleran…

Discussion

For vellykket analyse og rensing av uavhengige aktører, er det viktig å forstå den temperaturfølsomme innholdet i noen av disse proteiner. Visse anlegg aktørene kan bli ustabil ved temperaturer over 0 ° C, noe som resulterer i utfolding, nedbør og inaktivitet. For å oppnå aktive uavhengige aktører, er det ofte viktig at plantene blir behandlet i et kaldt rom (~ 4 ° C) og prøvene blir holdt på is i løpet av eksperimentering. En annen faktor å vurdere ved bruk av helcelle-rå lysater er nedbrytningen av pro…

Materials

1.5 mL microcentrifugetubes	Fisher	05-408-129
Adjustable lab jack	Fisher	S63080
Benchtop centrifuge	Desaga MC2
Brass probe	Custom built
Camera/ camera port	Canon		Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port
Cheesecloth	Purewipe/Fisher Scientific	06-665-25A
Concentration tubes (0.5 mL)	EMD Millipore	UFC501008
Concentration tubes (15 mL)	EMD Millipore	UFC900308
Conical tubes (50 mL)	Thermo Fisher	AM12502
Cooling block	VWR	13259	Use a metal heating block
Dehumidifier	Whirlpool		50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier
Dessciation beads	t.h.e. Dessicant/VWR	EM-DX0017-2	6-8 mesh size; 100% indicating
Dissection microscope	Olympus Tokyo
Double walled glass bowl	Generic		Purchase from local lab glassware supplier
Dry ice	Generic		Use local supplier; hazardous
EDTA-protease inhibitor tablets	Sigma Aldrich	11836170001	Roche cOmplete mini
Ethylene glycol	Generic		Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot)
Hexane	Sigma Aldrich	296090	Anhydrous, 95%; hazardous
Immersion oil	Sigma Aldrich	56822
JA10/20 centrifuge	Beckman
Large plastic petri dish	Generic
Liquid nitrogen	Generic		Use local supplier; hazardous
Magnetic stir plate	Hanna Instruments	HI190M
Microscope cover slides	Fisher	12-542A
Plastic tube	Generic		Purchase PVC pipe from local hardware store
Polarized film	Edmund Optics	43-781
Polystyrene foam	Generic		Can be constructed from polystyrene shipping boxes
Poreclain mortar and pestle	Fisher	FB961
PVPP	Sigma Aldrich	77627	110 µm particle size
Retort Stand	Fisher	12-000
Small stir bar	Fisher	14-513-51
Temperature-programmable water bath	VWR	13271-118
Vacuum grease	Dow Corning/Sigma Aldrich	Z273554
Vinyl tubing	Generic