तरीके उपकला परिवहन प्रोटीन समारोह और अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए मूल निवासी आंत और Caco-2 कोशिकाओं में 3 डी में बढ़ी
Summary
हम इन विट्रो सेल संस्कृति Caco-2 कोशिकाओं के 3 डी में उगाई मॉडल और माउस आंतों के एक पूर्व vivo मॉडल का उपयोग आंतों सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर (SERT) समारोह और अभिव्यक्ति के नियमन का अध्ययन करने के लिए सरल विधियों का वर्णन। इन विधियों अन्य उपकला ट्रांसपोर्टरों के अध्ययन के लिए लागू कर रहे हैं।
Abstract
आंतों उपकला महत्वपूर्ण परिवहन और बाधा कार्य करता है कि शरीर के सामान्य शारीरिक कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जबकि विदेशी कणों के लिए एक बाधा प्रदान करते हैं। बिगड़ा उपकला परिवहन (आयन, पोषक तत्व, या ड्रग्स) कई रोगों के साथ संबद्ध किया गया है और परिणाम है कि उपकला अखंडता और पेट Microbiome को प्रभावित करने से इस तरह के रूप ट्रांसपोर्टरों, के सामान्य शारीरिक कार्यों से परे का विस्तार हो सकता है। समारोह और परिवहन प्रोटीन के विनियमन को समझना उपचारात्मक उपायों में सुधार के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। उपकला परिवहन के अध्ययन में सबसे बड़ी चुनौती एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली है कि देशी आंतों उपकला कोशिकाओं की महत्वपूर्ण सुविधाओं का स्मरण दिलाता है विकसित कर रहा है। ऐसे Caco -2, टी -84 और HT-29-Cl.19A कोशिकाओं के रूप में कई इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल, आम तौर पर उपकला परिवहन अनुसंधान के क्षेत्र में उपयोग किया जाता है। ये सेल लाइनों ई मॉडलिंग करने के लिए एक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व न्यूनीकारकpithelium और उपकला माइक्रोबियल बातचीत की उनकी परीक्षा सहित कई यंत्रवत अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, सेल monolayers सही सेल सेल बातचीत और इन विवो microenvironment को प्रतिबिंबित नहीं करते। 3 डी में विकसित कोशिकाओं दवा पारगम्यता अध्ययन के लिए मॉडल का वादा किया जा करने के लिए दिखाया गया है। हम बताते हैं कि 3 डी में Caco-2 कोशिकाओं उपकला ट्रांसपोर्टरों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह भी महत्वपूर्ण है कि Caco-2 कोशिकाओं में अध्ययन के अन्य मॉडलों के साथ पूरित कर रहे हैं सेल विशिष्ट प्रभाव बाहर शासन करने के लिए और खाते में मूल निवासी आंत की जटिलता लेने के लिए। कई तरीकों पहले ऐसे everted थैली और पृथक उपकला कोशिकाओं में या अलग-थलग प्लाज्मा झिल्ली पुटिकाओं में तेज के रूप में ट्रांसपोर्टरों, की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। मॉडल के लिए सम्मान और परिवहन समारोह की माप के साथ क्षेत्र में चुनौतियों को ध्यान में ले रहा है, हम यहाँ एक प्रोटोकॉल 3 डी में Caco -2 कोशिकाओं के विकास और एक के रूप में एक ussing चैम्बर के उपयोग का वर्णन करने के लिए प्रदर्शनप्रभावी दृष्टिकोण ऐसे बरकरार ध्रुवीकृत आंतों epithelia में के रूप में सेरोटोनिन परिवहन, मापने के लिए।
Introduction
आंतों उपकला लुमेन में तरल पदार्थ का स्राव और आयनों के लिए विभिन्न परिवहन प्रोटीन (चैनलों, ATPases, सह-ट्रांसपोर्टरों और एक्सचेंजर्स) है कि पोषक तत्वों, इलेक्ट्रोलाइट्स के अवशोषण से लेकर कई कार्य करते हैं, और दवाओं के साथ सुसज्जित है। परिवहन प्रोटीन विद्युत ढ़ाल कि एक vectorial ढंग से आयनों या अणुओं के आंदोलन की अनुमति उत्पन्न करते हैं। यह ध्रुवीकृत उपकला कोशिकाओं के शिखर और basolateral झिल्ली में परिवहन व्यवस्था की विषम वितरण द्वारा हासिल की है। इसके अलावा, तंग जंक्शनों, जो आसन्न उपकला कोशिकाओं तार, शिखर और basolateral झिल्ली डोमेन के बीच घटकों के intramembrane प्रसार के लिए एक बाधा के रूप में सेवारत द्वारा इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उपयुक्त मॉडल सिस्टम मूल निवासी आंत के लिए इन विशिष्ट सुविधाओं नकल उतार (यानी polarity, भेदभाव, और तंग जंक्शन अखंडता) समारोह के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैंउपकला परिवहन व्यवस्था की nality।
मॉडल के लिए सम्मान के साथ, ठेठ सेल आंतों उपकला परिवहन अनुसंधान के क्षेत्र में वर्तमान में इस्तेमाल किया लाइनों, Caco -2, पूरी तरह से विभेदित की एक मॉडल हैं छोटे आंतों उपकला कोशिकाओं अवशोषण; और T84 कोशिकाओं या HT-29 subclones, तहखाना व्युत्पन्न बड़ी आंतों उपकला कोशिकाओं 1 की मॉडल। पारंपरिक, इन सेल लाइनों प्लास्टिक की सतहों में monolayers के रूप में या लेपित transwell सम्मिलित में बड़े हो रहे हैं। ट्रांस-अच्छी तरह से कुछ हद तक सेल संस्कृति सम्मिलित ध्रुवीकृत कोशिकाओं basolaterally को खिलाने के लिए अनुमति देकर इन विवो पर्यावरण जैसे लगते हैं। हालांकि, पारंपरिक 2 डी संस्कृति प्रणालियों में एक सीमा है कि कोशिकाओं को एक, कृत्रिम फ्लैट, और कठोर सतह के लिए अनुकूल करने के लिए मजबूर हैं। इस प्रकार, देशी epithelia के शारीरिक जटिलता सही रूप में एक 2 डी प्रणाली में परिलक्षित नहीं है। यह सीमा एक विशिष्ट microenvironment में 3 डी में कोशिकाओं को विकसित करने के तरीकों, इस तरह पतला प्रोटीन mixtur रूप से पार कर दिया गया हैई, बाह्य मैट्रिक्स घटकों 2, 3 की एक किस्म से युक्त। फिर भी, इन विट्रो संस्कृतियों आंतों उपकला, जो अनेक प्रकार की कोशिकाओं और आंत में क्षेत्र विशेष वास्तुकला है की जटिलता अनुकरण नहीं कर सकते। इस प्रकार, सेल संस्कृति मॉडल का उपयोग अध्ययन मूल निवासी आंत में आगे सत्यापन की आवश्यकता है। इन विट्रो 3 डी सेल संस्कृति और माउस आंत्र म्यूकोसा का उपयोग करना, हम यहाँ आंतों सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर (SLC6A4, SERT) के विनियमन का अध्ययन करने के लिए सरल विधियों का वर्णन।
निर्भर प्रक्रिया – SERT ट्रांसपोर्टर तेजी से एक ना + / सीएल के माध्यम से यह परिवहन के द्वारा, एक महत्वपूर्ण हार्मोन और न्यूरोट्रांसमीटर, 5 hydroxytryptamine (5 हिंदुस्तान टाइम्स) के बाह्य उपलब्धता को नियंत्रित करता है। SERT विरोधी अवसाद का एक ज्ञात लक्ष्य है और हाल ही में ऐसे दस्त और आंतों में सूजन के रूप में सैनिक विकारों, के एक उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में उभरा है।तरीके आंतों उपकला कोशिकाओं में 5 हिंदुस्तान टाइम्स तेज पहले से वर्णित किया गया है जांच करने के लिए। उदाहरण के लिए, Caco-2 कोशिकाओं प्लास्टिक का समर्थन करता है या पारगम्य सम्मिलित करता है पर हो दोनों शिखर और basolateral डोमेन 4 में Fluoxetine के प्रति संवेदनशील 3 एच-5-एचटी तेज प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है। मानव अंग दाता छोटी आंतों से तैयार पृथक ब्रश सीमा झिल्ली पुटिकाओं (BBMVs) में SERT समारोह का माप भी हमें 5 से वर्णित किया गया है। 3 मानव BBVMs में एच-5-HT तेज Fluoxetine के प्रति संवेदनशील हैं और ना + / सीएल होना दिखाया गया था – निर्भर है, और यह 300 के एक कश्मीर मीटर एनएम 5 के साथ संतृप्ति कैनेटीक्स प्रदर्शन किया। इसी तरह के तरीकों का उपयोग, हम भी पहले से SERT समारोह माउस आंतों BBMVs 6 में 3 एच-5-एचटी तेज के रूप में मापा जाता है। हालांकि, शुद्ध प्लाज्मा झिल्ली पुटिकाओं की तैयारी ऊतक म्यूकोसा की एक बड़ी राशि की आवश्यकता है। ऐसे radiog के रूप में अन्य तरीकों,3 एच-5-एचटी तेज साइटों की raphic दृश्य, भी गिनी पिग और चूहे छोटी आंतों 7 में पहले से दिखाया गया है।
Ussing चैम्बर आयनों, पोषक तत्वों, और विभिन्न उपकला ऊतकों भर में दवाओं के परिवहन को मापने के लिए एक अधिक शारीरिक प्रणाली प्रदान करता है। Ussing चैम्बर तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि इसे बरकरार, ध्रुवीकृत आंतों उपकला की बिजली और परिवहन मानकों के सटीक माप के लिए सक्षम बनाता है। इसके अलावा, आंतरिक neuromuscular प्रणाली के प्रभाव को कम करने के लिए, आंत्र mucosa की seromuscular स्ट्रिपिंग उपकला 8 में ट्रांसपोर्टरों के विनियमन की जांच करने के लिए किया जा सकता है।
हम जानते हैं कि Caco-2 कोशिकाओं पतला प्रोटीन पर 3 डी में उगाई अलग शिखर और basolateral मार्करों व्यक्त एक खोखले लुमेन फार्म का प्रदर्शन। इन कोशिकाओं को 2 डी Caco -2 कोशिकाओं की तुलना में SERT की उच्च अभिव्यक्ति दिखा। 3 डी तरीके कोशिकाओं को विकसित करने के लिए और पीई के लिएrform immunostaining या शाही सेना और प्रोटीन निकासी वर्णित हैं। इसके अलावा, हम एक ussing चैम्बर तकनीक का उपयोग करके छोटे आंत्र mucosa में TGF-β1, एक pleiotropic साइटोकाइन, द्वारा SERT समारोह और विनियमन का अध्ययन करने के तरीकों का वर्णन है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पूरी तरह से विभेदित Caco -2 सेल monolayers बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है उपकला monolayers ध्रुवीकरण के रूप में आंतों परिवहन 10, 11, 12, 13, 14, 15 अध्?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Christopher Manzella, MD/PhD student in the RKG laboratory, for helping to edit and proofread our manuscript.
Materials
| 10X PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10X PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95%O2- 5%Co2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa FluorPhalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| BSA | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| CaCo2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013–032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| TritonX-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
Referências
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