Denne protokol beskriver brugen af sump svaberprøver og slam analyse af zebrafisk systemer, hvilket fører til øget påvisning i forhold til den eneste brug af sentinels at opdage patogener som Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. og Pseudocapillaria tomentosa. Det foreslås også et system til at overvåge P. tomentosa æggene i karantæne.
Sundhed overvågningssystemer er udviklet og anvendes i zebrafisk forskningsfaciliteter, fordi patogener af Danio rerio Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. og Pseudocapillaria tomentosa har potentiale til at forringe dyrenes velfærd og forskning. Fiskene er typisk analyseret efter slagtning til at opdage mikrober. Brugen af sentinels er foreslåede måde at forbedre følsomheden af overvågning og at reducere antallet af dyr for smagsløgene. Indstilling af en pre filtrering sentinel tank ud af en recirkulerende system er beskrevet. Teknikken er udviklet til at forhindre vandforurening og til at repræsentere befolkningens fisk af en omhyggelig udvælgelse af alder, køn og stammer. Bruge Mindsteantallet af dyr, er teknikker til at screene for miljøet også detaljeret. Polymerase Chain Reaction (PCR) på overfladen sump svaberprøver bruges til at forbedre afsløring af nogle udbredt og patogene mykobakterielle arter som Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilumog Mycobacterium chelonae. En anden miljømæssig metode består af behandling af slam på bunden af en holdingtank eller sump hen til kigge efter P. tomentosa æg. Dette er en hurtig og billig teknik, der kan anvendes i karantæne, hvor en avl enhed er neddykket i holdingtank af importerede dyr. Endelig, PCR anvendes til slam prøven og A. hydrophila er fundet på sumpen bund og overflade. Generelt, disse miljømæssige screening teknikker anvendes til disse specifikke patogener har ført til en øget følsomhed i forhold til afprøvning af Pre filtrering sentinels.
For at beskytte forskning og dyrevelfærd1,2, overvåges tilstedeværelsen af patogener inden for animalsk faciliteter. For zebrafisk, sundhedsovervågning,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ofte beror på dyr analyseret slagtningen af histopatologi, bakteriologi kultur eller molekylære metoder. Test kun koloni dyr er ikke den anbefalede metode på grund af antallet af fisk og dermed forbundne udgifter, der ville være forpligtet til at registrere patogener af lav prævalens. Derfor er den foretrukne metode til at afsløre en lille gruppe af dyr til en højere belastning af forurenende stoffer. Disse fisk kaldes før filtrering sentinels. Denne udsættelse varer for måneder og det indebærer en stigning i den animalske omsorgsgiver arbejdsbyrde og/eller nogle specialbyggede engineering løsning. En anden udfordring er screening af importerede linjer i karantæne hvor de frugtbare dyr skal holdes i live og dette er ikke kompatibel med rutinemæssig assays på slagtekroppe.
Her beskriver vi nogle metoder til at opdage visse zebrafisk patogener (A. hydrophila, Mycobacterium spp., og P. tomentosa) ved screening af akvatiske systemmiljø. Målet er at reducere antallet af fisk, der anvendes til sundhedsovervågning af og optimering af omsætning, omkostninger og følsomheden af påvisning. Sådanne metoder er et alternativ til brugen af dyr og nogle teknikker kan anvendes til screening import i karantæne. For eksempel, Mocho9 var i stand til at identificere flere patogene mykobakterielle arter ved at udføre PCR på sump svaberprøver frem for zebrafisk (herunder sentinels), og dette blev opnået med færre prøver. I den samme undersøgelse, P. tomentosa æg blev opdaget med større følsomhed af screening tank slam ved hjælp af flotation og mikroskopi i stedet for at teste fisk af PCR og histopatologi.
Tabel 1 er en oversigt over de forskellige karakteristika af sentinel programmer3,4,5,6,7,8,9,10 bruges af en række zebrafisk faciliteter. Efter filtrering sentinels modtager vand på samme måde som enhver koloni fisk før filtrering sentinels modtage vandet når det har rundsendt via koloni akvarier først. For eksempel kan før filtrering sentinels sættes op på recirkulerende systemet ved løbende modtager sump vand. Dette kan ikke være en mulighed, når der er mange uafhængige systemer i ét rum. I dette tilfælde kan en tank af Pre filtrering sentinels bruges til at screene hele rummet. Sentinels er i en statisk tank, til recirkulerende således, og deres vand er ændrede regelmæssigt, bruger kun Pre filtrering vand dvs, sump vand fra alle systemer i rummet. Denne teknik er beskrevet nedenfor som en baseline til sammenligning med effekten af de miljøscreening. Den foreslåede set-up er designet til at kontrollere vand kvalitetsspørgsmål som et fald i pH eller en kvælstof forureningen.
Begrebet den bakterielle miljøscreening er baseret på den hypotese, at bakterier er påviselige i biofilm som den, der fandt på sump væggen på vandoverfladen eller i slam på bunden af en tank. Sump synes en ideel indsamlingspunkt i en recirkulerende akvakultur system da det indsamler affald (vand, afføring, foder og andet organisk materiale) fra alle tanke før filtrering. Overfladen af sumpen er ofte nemt nås, af svaberprøven er hurtig, og det kan udføres under aseptiske forhold for at undgå kontaminering af prøven (fra handsker for eksempel). Begrebet bruges til at identificere fremherskende patogene Mycobacterium spp. i zebrafisk systemer9,12. Teknikken er beskrevet nedenfor og vi også rapporterer påvisning af A. hydrophila i zebrafisk sump overflade svaberprøver og slam.
Miljøscreening for parasit æg er baseret på påvisning af Murray et al. 13 og flotation teknik anvendes rutinemæssigt til parasitologi og mikroskopiske screening af parasit æg i afføring14. Mocho9 foreslås en alternativ til prøvetagning proces og viste, at teknikken kan bruges til at registrere andre arter af fisk biotop. Inficerede D. rerio passere P. tomentosa æg med deres afføring og parasit æg forblive i bunden af tank, i slammet. De kan der være indsamlet på grund af deres tæthed bliver større end vand. Tætheden af æggene bruges til at behandle den miljømæssige prøve også. En første flotation med centrifugering adskiller vand og lys snavs fra tungere sag. En anden centrifugering afhængig mættet sukkeropløsning (med en massefylde større end tætheden af P. tomentosa æg) for at give mulighed for parasit-æg at dukke op på overfladen af glasset.
Screening for bakterier i biofilm og P. tomentosa fra bunden af tanken kan kombineres ved at udføre PCR for alle disse patogener på slam prøve sediment fremstillet efter den første centrifugering. Dette optimerer Prøvetagningstiden. Metoden, der er beskrevet nedenfor. Vi foreslår også at anvende disse teknikker i forbindelse med karantæne. Gennemgå importerede voksen zebrafisk, som skal holdes i live, er en avl enheden indsat til karantæne tank. Efter en uge, er afføring og andre affaldsmaterialer i avl enhed indsamlet og screenes ved mikroskopi eller PCR. Teknikken er beskrevet nedenfor og nogle P. tomentosa æg var blevet opdaget ved mikroskopi i denne sammenhæng.
Begrænsninger af teknikkerne, kritiske faser, og fejlfinding:
Alder, køn, stamme og varigheden af eksponering af Sentinel-missionerne er ikke standardiseret. Dette er vist i tabel 1. Der er meget lidt screening af fisk under 6 måneder i alder eller ældre fisk. Der kan være nogle patogener, der påvirker de unge fisk, som der er nogle patogener, der er mere udbredt i den ældre befolkning10,18,19,20. Køn betragtes på samme måde, ikke i udvælgelsen af visse sentinel grupper trods nogle rapport, at der er en kønsskævhed for nogle patogener21. Den foreslåede teknik forsøger at løse disse problemer, selv om valget af stammen kunne foretages efter en specifik pathogen at overvåge. For eksempel, TU kunne hjælpe med påvisning af Mycobacterium spp.12,22, men der er en risiko for, at sentinels vil derefter fungere som et reservoir eller viser kliniske tegn. Vedrørende længden af eksponering øger tilgang af zebrafisk International Resource Center10 chancerne for at opdage patogener, som kunne være gået glip af med en utilstrækkelig forurening periode. Behovet for længerevarende eksponering indebærer, at Sentinel ikke er let tilgængelige. Tilføjelsen af de miljøprøver tillader nogle fleksibilitet og multiplikation af hændelserne screening. For eksempel, kan prøveudtagning finde sted hver anden måned med en 4 måneders interval mellem hver screeningsmetode. Dette kan reducere bortfalder om tid, før en nyligt indførte patogen er opdaget.
Miljøscreening teknikker stole på påvisning af patogener i miljøet. Patogener er udgydt af fisken og derfor fortyndet i vand system. Muligheden for indfange patogener af vandfiltrering23 blev ikke udforsket. De metoder vi beskrive er kun effektiv, hvis patogener får tilstrækkelig tid til at formere sig i fisk og biofilm at nå en grænseværdi for kontaminering giver mulighed for påvisning. Denne begrænsning af teknikkerne, der er minimeret ved en kritisk udvælgelsen af stikprøver websteder: slam i tanken er i stedet for sump slam, og vand og biofilm er stikprøven på overfladen af sumpen og ikke i en tank eller efter filtrering. Alle prøver fra det samme system er imidlertid usandsynligt, at give de samme resultater. Positive resultater for P. tomentosa kan bekræftes ved hjælp af en anden assay (histopatologi, PCR eller slam analyse). Mykobakterielle PCR positive resultater kan bekræftes af kultur eller en anden diagnostisk laboratorium. Når der etableres en sundhedsstatus, yderligere anbefales prøver dog at bekræfte negative resultater fra nogen miljøscreening teknik.
Betydningen af teknikken med hensyn til eksisterende/Alternative metoder:
Mycobacterium spp. er almindelige i miljøet og deres tilstedeværelse i sumpen forudsige ikke deres patogenicitet12. Mocho9 viste, at overvågningen dødelighed er nøglen til at kortlægge udviklingen af sundhedsspørgsmål. Brug af animalsk prøver er fortsat afgørende for enhver veterinær undersøgelse. Sundhedsovervågning indebærer påvisning af alle udbredte patogener i en facilitet, og dette kan ikke opnås ved udelukkende brug af miljømæssige screening teknikker. Ikke desto mindre kan en manglende forståelse af diagnose værktøjer forsinke eller forhindre en nøjagtig beskrivelse af sundhedsstatus. Mens brugen af sentinels reducerer antallet af fisk, der kræves til at opdage en udbredt mikrobe i befolkningen, tilføjer manglen på følsomhed vægt ved hjælp af en kombination af metoder, herunder miljøscreening5,23. Faktisk er den specifikke patogen gratis status normalt defineret som fravær af en art i anlægget således, at miljø og dyrs prøver skal teste negativ24,25.
Sump vatpind resultater at identificere Mycobacterium spp. viser, at påberåbe sig fisk prøver kan føre til en falsk negative sundhedsmæssige status. 6 testet mykobakterielle arter er beskrevet som patogene eller potentielle patogene i zebrafisk15 og nogle ville ikke blive fjernet af æg overflade desinfektion med klor26 som rutinemæssigt udføres i karantæne. Derfor, den falske negative kan få nogle konsekvenser for samarbejdspartnere, der importerer linjer. For eksempel, M. fortuitum var savnet ved PCR på fisk prøve men mere end halvdelen af sump vatpinden PCR opdaget sig. I betragtning af at disse mykobakterier er mere modstandsdygtige over for klor end andre og deres evne til at vokse i vandsystemer27, er det en risiko for ikke-forurenet import faciliteten. For at tillade import af linjer, skal ledere stole og sammenligne sundhedsrapporter af det eksporterende facilitet med deres. ICLAS ydeevne evaluering Program28 er nøglen til denne proces i gnavere. RESAMA netværk rapporter påvisning af M. gordonae og M. mucogenicum i fransk D. rerio11. Disse mykobakterier er ikke foreslået i paneler af de kommercielle laboratorier, som vi bruger. Det ville være nyttigt at udvide programmet ICLAS og harmonisere de diagnostiske assays samt listen over patogene arter29.
A. hydrophila er også et patogen, der har potentiale til at blive indført ved import af dyr, selv om dens følsomhed over for klor30 gør dens afskaffelse mere sandsynligt under rutinemæssige æg overflade desinfektion. Sump, svaber og Slam resultater viser, at miljøscreening kan anvendes til at påvise dette patogen. Andre bakterier som Mycobacterium spp. er blevet påvist i slammet af PCR23. Denne type prøve er særlig relevant, da det giver mulighed for påvisning af skur patogener. For eksempel, er en anden ny ansøgning slam analyse til at screene importerede fisk i karantæne for P. tomentosa. Parasitten er en trussel mod dyrets sundhed13 og neoplasi modeller16. Derudover er klor koncentrationerne anvendes i rutinemæssige zebrafisk æg overflade desinfektion ikke effektiv31. Derfor, evnen til at screene de importerede dyr med en uges omsætning og uden nogen fisk eutanasi synes meget attraktiv. Denne teknik kan påvirke karantæne og biosikkerhedsforanstaltninger reglerne ved at tillade en triage af importen. En beslutningsproces er derefter designet efter de fremherskende patogener i det eksporterende facilitet, de fundne patogener i prøver fra den importerede fisk og risiko for at kompromittere den importerende facilitet10sundhedstilstand.
Fremtidige ansøgninger eller retninger efter beherske disse teknikker:
Selv om rutinemæssig karantæne behandling er den valgte løsning, kan effekten af sådan medicin32,33,34,35,36 vurderes med avl enhed slam analyse. Mere generelt den miljøscreening kunne bruges til at teste forbindelser mod bakterier og parasit udryddelse, herunder i fisk biotop. En anden niche anvendelse af miljømæssig screening er at overvåge befolkningens patogen i live feed37,38. Selv om den vigtigste anvendelse af disse teknikker er som et værdifuldt supplement til diagnosticering værktøjskassen for sundhedsovervågning i zebrafisk faciliteter. Takket være en mere præcis, omkostninger og tid effektiv definition af sundhedsstatus, sump svaberprøver og slam analyse er komplementær til sentinel overvågning og rutinemæssig karantæne praksis. Faktisk er fremtiden for disse teknikker at være en rutinemæssig del af enhver akvatiske laboratorium sundhedsrapport.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke kvalitet Aquatics team af Francis Crick Institut for deres tekniske hjælp og kritiske input. Dette arbejde blev støttet af Francis Crick Institute, som modtager sin basisfinansiering fra Cancer Research UK (FC001999), det britiske Medical Research Council (FC001999) og the Wellcome Trust (FC001999).
Aqua-Sed 250 mL | Vetark | 2-phenoxyethanol | |
Tubed Sterile Dryswab Tip | mwe | MW100 | Sump surface |
BD Plastipak Disposable Syringe 50mL Eccentric | Becton Dickinson |
300866 | They are actually graduated to 60 ml |
Centrifuge tube 15 mL Corning | Corning | 430766 | |
Centaur 2 benchtop centrifuge with 4 x 200 mL Swing–Out Rotor (unsealed) | Sanyo | MSB020.CX1.5 | |
Cover Glass 22 mm x22 mm | Menzel-Glaser | MNJ-350-020H | |
Plain Swab Sterile Plastic Applicator Rayon Tipped White Cap | Sterilin Ltd Thermo Fisher Scientific | F155CA | Swab sediment from sludge |
50 mL Self-Standing Centrifuge Tube CentriStar Cap | Corning | 430921 | |
In-Tank Spawning Tray Set | MBK Installations Ltd |