Denne protokollen beskriver bruk av sump vattpinner og slam analyse av sebrafisk systemer, som fører til økt oppdagelsen forhold til eget bruk av voktere å oppdage patogener som Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. og Pseudocapillaria tomentosa. Et system for å overvåke P. tomentosa egg i karantene er foreslått.
Helse overvåking systemer er utviklet og brukt i sebrafisk forskningsanlegg fordi patogener i Danio rerio som Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. og Pseudocapillaria tomentosa har potensial til å svekke dyrevelferd og forskning. Fisken er vanligvis analysert post mortem å oppdage mikrober. Bruk av voktere er en foreslått måte å forbedre følsomheten til overvåking og redusere antall dyr å prøve. Innstillingen for en pre filtrering sentinel tank av et resirkulerende system er beskrevet. Teknikken er utviklet til å hindre vannforurensning og representerer fiskebestanden av valget av alder, kjønn og stammer. Bruke minimum antall dyr, er teknikker til skjermen miljøet også detaljert. Polymerase kjedereaksjon (PCR) på overflaten sump vattpinner brukes til å forbedre gjenkjenning av enkelte utbredte og sykdomsfremkallende mycobacterial arter som Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilumog Mycobacterium chelonae. En annen miljømessig metoden består av behandling slam på bunnen av en holder tank eller sump å lete etter P. tomentosa egg. Dette er en billig og rask teknikk som kan brukes i karantene der en avl enhet er neddykket i holde tanken importert dyr. Endelig PCR gjelder slam prøven og A. hydrophila er oppdaget på bunnpannens bunnen og overflate. Vanligvis har disse miljøtester teknikkene til disse bestemte patogener ført til en økt følsomhet sammenlignet med testing av pre filtrering voktere.
For å beskytte forskning og dyrevelferd1,2, overvåkes tilstedeværelse av patogener i dyr fasiliteter. Ved sebrafisk, sunnhet avlytting3,4,5,6,7,8,9,10,11 ofte avhengig av dyr analysert post mortem av histopatologi, bakteriell kultur eller genetiske metoder. Testing bare kolonien dyr er ikke den anbefalte metoden på grunn av fisk og relaterte kostnader som kreves for å oppdage patogener lav prevalens. Derfor, den foretrukne metoden er å eksponere en liten gruppe dyr til en større belastning av miljøgifter. Disse fiskene kalles pre filtrering voktere. Denne eksponeringen varer i måneder, og det innebærer en økning i dyr pleierens arbeidsmengde og/eller noen spesialbygde engineering løsning. En annen utfordring er screening av importerte linjene i karantene der fruktbare dyrene er holdes i live og dette er ikke kompatibel med rutinemessig analyser på skrotter.
Her beskriver vi noen metoder for å oppdage bestemte sebrafisk patogener (A. hydrophila, Mycobacterium spp. og P. tomentosa) av screening akvatiske systemets miljø. Målet er å redusere antall fisk brukes for helseovervåking og optimalisere omsetning, kostnad og følsomhet for gjenkjenning. Slike metoder er et alternativ til bruk av dyr og noen teknikker kan brukes til screening import i karantene. For eksempel Mocho9 klarte å identifisere flere sykdomsfremkallende mycobacterial arter ved å utføre PCR på sump vattpinner ikke på sebrafisk (inkludert voktere), og dette ble oppnådd med færre prøver. I den samme studien, P. tomentosa egg ble oppdaget med mer følsomhet av screening tank slam flotasjon og mikroskopi i stedet for å teste fisken PCR og histopatologi.
Tabell 1 oppsummerer de forskjellige egenskapene til sentinel programmer3,4,5,6,7,8,9,10 brukes av en rekke sebrafisk fasiliteter. Etter filtrering voktere får vann på samme måte som noen kolonien fisk mens pre filtrering voktere motta vann når det har sirkulert gjennom kolonien akvarier først. For eksempel kan pre filtrering voktere defineres på resirkulerende systemet ved å motta kontinuerlig sump vann. Dette kan ikke være et alternativ når det er mange uavhengige systemer i ett rom. I dette tilfellet kan en tank av pre filtrering voktere brukes til skjermen hele rommet. Skiltvaktene er i en statisk tank, av resirkulerende systemet, vann endres regelmessig, med bare pre filtrering vann dvssump vann fra alle systemene i rommet. Denne teknikken er beskrevet nedenfor som en baseline for sammenligning med effekten av miljømessige screening. Det foreslåtte oppsettet er utformet for å kontrollere problemer med vannkvaliteten som en nedgang på pH eller en Nitrogenforurensningen.
Begrepet den bakterielle miljøtester avhengig hypotesen at bakterier er synlig i biofilm som man finner på sump veggen på vannflaten eller slam nederst i en tank. Bunnpannen synes en ideell prøvepunkt i et resirkulerende akvakultur system siden samler avfall (vann, avføring, fôr og annet organisk materiale) fra alle tanker før filtrering. Overflaten av bunnpannen er ofte lett tilgjengelig, det swabbing er rask og kan utføres tas aseptisk for å unngå kryss-kontaminering av prøven (fra hansker for eksempel). Begrepet brukes til å identifisere utbredt patogene Mycobacterium spp. sebrafisk systemer9,12. Teknikken er beskrevet nedenfor og vi rapporterer også påvisning av A. hydrophila i sebrafisk sump overflaten vattpinner og slam.
Miljøtester for parasitt egg er basert på oppdagelsen av Murray et al. 13 og flotasjon teknikken brukes rutinemessig for parasittologi og mikroskopiske screening av parasitt egg i avføring14. Mocho9 foreslått et alternativ til prøvetaking prosessen og viste at teknikken kan brukes til å oppdage andre arter av fisk naturtypen. Infiserte D. rerio passerer P. tomentosa egg med deres avføring og parasitten eggene blir værende på bunnen av tanken, i slam. De kan være samlet det på grunn av tetthet deres større enn vann. Tettheten av eggene brukes til å behandle miljømessige prøven også. Første Kjør med sentrifugering skiller vannet og lys rusk fra tyngre saken. En andre sentrifugering er avhengig av mettet sukkeroppløsning (med en tetthet som er større enn tettheten av P. tomentosa egg) for å tillate parasitt egg å komme på overflaten av røret.
Screening for bakterier i biofilm og P. tomentosa fra bunnen av tanken kan kombineres ved å utføre PCR for alle disse patogener på slam eksempel sediment innhentet etter den første sentrifugering. Dette optimaliserer prøvetidspunkt. Metoden som er beskrevet nedenfor. Vi foreslår også å bruke disse teknikkene i karantene sammenheng. Til skjermen importerte voksen sebrafisk som må holdes i live, settes en avl enhet til karantene tanken. Etter en uke, er avføring og annet avfall i avl enheten samlet og vist av mikroskopi eller PCR. Teknikken er beskrevet nedenfor og noen P. tomentosa egg ble oppdaget av mikroskopi i denne sammenheng.
Begrensninger av teknikker, avgjørende skritt, og feilsøking:
Alder, kjønn, belastning, og lengden på eksponering av sentinels er ikke standardiserte. Dette er vist i tabell 1. Det er svært lite screening av fisk under 6 måneder eller år fisk. Det kan være noen patogener som påvirker den unge fisken som det er noen patogener som er mer utbredt i de eldre befolkning10,18,19,20. Tilsvarende er kjønn ikke vurdert i valg av noen sentinel grupper til tross for noen rapporten at det er en kjønns bias for noen patogener21. Den foreslåtte teknikken prøver å løse disse problemene, men valg av belastningen kan gjøres etter en bestemt patogen overvåke. For eksempel TU kunne hjelpe med oppdagelsen av Mycobacterium spp.12,22, men det er en risiko som sentinels vil da fungere som et reservoar vise eller klinisk underskriver. Om hvor lang eksponering øker tilnærming av sebrafisk International Resource Center10 sjansene å oppdage patogener som kan være savnet med en utilstrekkelig forurensning periode. Behovet for langvarig eksponering innebærer at voktere ikke er tilgjengelige. Tillegg av miljøprøver kan litt fleksibilitet og multiplikasjon av screening hendelsene. For eksempel kan prøvetaking finne sted hver andre måned med en 4 måneders intervallet mellom hver screening metode. Dette kan redusere bortfall av tid før en nylig introduserte patogen oppdages.
Miljøtester teknikker er avhengige av gjenkjenning av patogener i miljøet. Patogener er skur av fisken og derfor fortynnet i vann system. Muligheten for å fange patogener av vann filtrering23 var ikke utforsket. Metodene vi beskrive er bare effektiv hvis patogener er gitt nok tid å multiplisere fisk og biofilm å nå en terskel forurensning tillater gjenkjenning. Denne begrensningen av teknikkene minimeres ved et kritisk utvalg av webområdene prøvetaking: slam i tanken samples enn sump slam og vann og biofilm samples i overflaten av bunnpannen og ikke i en tank eller post filtrering. Likevel er alle prøvene i samme system neppe til å gi samme resultat. Positive resultater for P. tomentosa kan bekreftes ved å bruke en annen analysen (histopatologi, PCR eller slam analyse). Mycobacterial PCR positive resultater kan bekreftes ved kultur eller en annen diagnostisk laboratorium. Men når etablerende en helsetilstand, er ytterligere eksempler anbefalt å bekrefte negative resultater fra noen miljøtester teknikk.
Betydningen av teknikken med hensyn til eksisterende/Alternative metoder:
Deres tilstedeværelse i bunnpannen ikke forutse ikke deres virusets12 Mycobacterium spp. er vanlig i miljøet. Mocho9 viste at overvåking dødelighet er nøkkelen å kartlegge utviklingen av helseproblemer. Bruk av dyr prøvene er fortsatt viktig å en veterinary undersøkelse. Helseovervåking innebærer påvisning av alle utbredt patogener i anlegg, og dette kan ikke oppnås med eget bruk miljøtester teknikker. Likevel, mangel på sensitivitet diagnose verktøy kan forsinke eller forhindre en nøyaktig beskrivelse av helsetilstanden. Mens bruken av voktere reduserer antall fisk kreves for å gjenkjenne en utbredt mikrobe i befolkningen, legger mangel på sensitivitet vekt til å bruke en kombinasjon av metoder, inkludert miljøtester5,23. Faktisk er bestemt patogen gratis status vanligvis definert som fravær av en art i anlegget slik at miljø og dyr må teste negative24,25.
Sump vattpinne resultatene å identifisere Mycobacterium spp. viser at stole på fisk prøver kan føre til en falsk negativt helsetilstand. 6 testet mycobacterial arter er beskrevet som patogene eller potensial patogene i sebrafisk15 og noen ville ikke bli eliminert av egg overflaten desinfeksjon med klor26 som rutinemessig utført i karantene. Falske negative kan derfor ha noen konsekvenser for samarbeidspartnere som importere linjer. For eksempel M. fortuitum var savnet av PCR på fisk utvalg, men mer enn halvparten av sump vattpinnen PCR oppdaget den. Tatt i betraktning at disse mykobakterier er mer motstandsdyktig mot klor enn andre og deres evne til å vokse i vann systemer27, er det en risiko for ikke-forurenset import anlegget. For å tillate import av linjer, må ledere stole og sammenligne rapportene av eksport med deres. ICLAS ytelse evaluering Program28 er nøkkelen til denne prosessen i gnagere. RESAMA nettverket rapporterer oppdagelsen av M. gordonae og M. mucogenicum i fransk D. rerio11. Disse mykobakterier er ikke definert i paneler av kommersielle laboratorier som vi bruker. Det ville være nyttig å utvide ICLAS programmet og for å harmonisere de diagnostiske analyser som listen over patogene arter29.
A. hydrophila er også en patogen som har potensial til å bli introdusert når du importerer dyr, selv om sin mottakelighet for klor30 gjør sin eliminering mer sannsynlig under rutinemessig egg overflaten desinfisering. I sumpen, vattpinne og slam resultater viser at miljøtester kan brukes til å oppdage denne patogen. Andre bakterier som Mycobacterium spp. oppdages i slam av PCR23. Denne typen utvalg er spesielt relevant siden gjør påvisning av skur patogener. En annen ny program er for eksempel slam analyse til skjermen importerte fisk i karantene for P. tomentosa. Parasitten er en trussel til dyrets helse13 og neoplasi modeller16. Videre er klor konsentrasjoner i rutinemessig sebrafisk egg overflaten desinfeksjon ikke effektiv31. Derfor, kan skjermen importerte dyrene med en ukes omsetning og uten noen fisk euthanasia synes svært attraktive. Denne teknikken kan påvirke karantene og biosikkerhet reglene ved å tillate en triage av import. En beslutningsprosess så laget etter utbredt patogener i eksport anlegget, oppdaget patogener i prøvene fra den importerte fisken og risikoen for at helsetilstanden til import anlegget10.
Framtidige applikasjoner eller etter mestre disse teknikkene:
Selv om rutinemessig karantene behandling alternativet valgt, kan effekten av slike medisiner32,33,34,35,36 vurderes med avl enheten slam analyse. Mer generelt, miljømessige screening kan brukes til å teste forbindelser mot bakterier og parasitten utrydding, inkludert fisk naturtypen. En annen nisje søknad av miljømessige screening er å overvåke patogen befolkningen i live feed37,38. Men den viktigste anvendelsen av disse teknikkene er som et verdifullt tillegg til diagnose verktøykassen for helse overvåking sebrafisk fasiliteter. En mer nøyaktig, kostnader og tid effektiv definisjon av helsetilstand, sump vattpinner og slam analyse er komplementære til sentinel overvåking og rutinemessig karantene praksis. Fremtiden for disse teknikkene er faktisk å være en rutinemessig del av akvatiske laboratorium helse rapporter.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke BRF svømming laget av Francis Crick Institute for teknisk hjelp og kritiske inndata. Dette arbeidet ble støttet av Francis Crick Institute som mottar sin kjernen finansiering fra kreftforskning Storbritannia (FC001999), UK Medical Research Council (FC001999) og Wellcome Trust (FC001999).
Aqua-Sed 250 mL | Vetark | 2-phenoxyethanol | |
Tubed Sterile Dryswab Tip | mwe | MW100 | Sump surface |
BD Plastipak Disposable Syringe 50mL Eccentric | Becton Dickinson |
300866 | They are actually graduated to 60 ml |
Centrifuge tube 15 mL Corning | Corning | 430766 | |
Centaur 2 benchtop centrifuge with 4 x 200 mL Swing–Out Rotor (unsealed) | Sanyo | MSB020.CX1.5 | |
Cover Glass 22 mm x22 mm | Menzel-Glaser | MNJ-350-020H | |
Plain Swab Sterile Plastic Applicator Rayon Tipped White Cap | Sterilin Ltd Thermo Fisher Scientific | F155CA | Swab sediment from sludge |
50 mL Self-Standing Centrifuge Tube CentriStar Cap | Corning | 430921 | |
In-Tank Spawning Tray Set | MBK Installations Ltd |