Den primære cilium er fundamentalt viktig i neurale stamcelle proliferasjon, neuronal differensiering, og voksen neuronal funksjon. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å studere ciliogenesis og trafikkering av signalisering proteiner til cilia i nervestammen / forløperceller og differensierte nevroner ved hjelp av primær neurosfærekulturer.
The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.
Den primære cilium er et mikrotubuli-baserte dynamisk subcellulære kammer som fungerer som en sensorisk antenne for å samordne cellulære signalveier, inkludert sonic hedgehog (Shh) veien under embryonal nevronal utvikling 1, 2, og romoppdelt subcellulær signalisering i voksen neuronal funksjon 3, 4 . Aliserte komponenter av disse reaksjonsveier, for eksempel Shh reseptoren Lappet 5; veien aktivator glattes (Smo) 6; og Gpr161 7, en orphan G-protein-koblet reseptor (GPCR) som negativt regulerer Shh veien, lokalisere til cilia på en dynamisk måte. Multiple GPCRs har blitt rapportert til å lokalisere å cilia i neuroner i hjernen 7, 8, 9, 10 </sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defekter i cilia og cilia-genererte signalveier påvirke flere vev og er kollektivt kjent som ciliopathies 17, 18, 19. Den ciliopathy sykdom spekteret inneholder ofte nevrologiske defekter, slik som kraniofaciale abnormiteter 20, 21, 22. I tillegg, primær cilia i hypothalamus neuroner regulere sentrale metthetsfølelse veier, og defekter resultere i sentral fedme 23, speiling fedme i syndrom ciliopathies som Bardet Biedel syndrom 24. I tillegg, neuropeptid-reseptor-signalering i cilia regulerer central metthetsfølelse baner 11, 14. Ciliær lokalisering av adenylylcyklase III (ACIII) og GPCR som somatostatinreseptor 3 i hippocampalneuroner resultere i nye objekt gjenkjennelsesfeil og hukommelsessvikt 25, 26 og parallell til en mangel på integritet ciliære 27. Utviklingsområder av cilia-genererte signalering er nært knyttet til vev homeostase; Særlig cilia er viktige for utviklingen av Shh-subtype Medulloblastomas som følge av granule progenitorceller i lillehjernen 28, 29. Dermed primære flimmerhårene spiller viktige roller under embryonal, postnatal og voksen neuronal utvikling og funksjon.
Neurale stamceller (NSC) ligge i subventricular sone (SVZ) av den laterale ventrikkel subgranular sone av dentate gyrus av hippocampus, og denventrikulær sone av den tredje ventrikkel i hypothalamus hos pattedyr 30, 31, 32. NSC er multi, har evne til selvfornyelse, og er viktig for hjernens utvikling og regenerativ medisin 30. De fleste NSCs i SVZ er stillestående og har en enslig primær cilium som, i mange tilfeller, strekker seg ut til den laterale ventrikkel 33. De primære cilium signalene via lokalisering av forskjellige reseptorer, indusere nedstrøms cellulære responser, spesielt i forhold til Shh, TGFp, og reseptor-tyrosin-kinase-reaksjonsveier 2, 34, 35, 36. Siden primær cilia strekker seg inn i den laterale ventrikkel, er det en hypotese at primær cilia detektere cytokiner i cerebrospinalvæsken (CSF) for å aktivere NSCs 37 </sopp>. Nylige studier tyder på at den Shh signalveien og primær cilia er kritiske for aktivering av stamceller ved reparasjon og regenerasjon av flere vev, inkludert det olfaktoriske epitel, lunge, nyre og 38, 39, 40, 41. Imidlertid, de mekanismer som står i forbindelse med CSF NSCs og om primær cilia er involvert er ikke kjent. Adherente NSCs i kultur er cilierte; lokalisere shh pathway komponenter, for eksempel Smo og Gpr161 i cilia; og er Hysj responsive 42. Således kan NSCs tjene som et viktig modellsystem for å studere Shh vei, ciliær trafikk, og neuronal differensiering veier. I tillegg kan neuroner differensiert fra NSC også anvendes for ciliære trafikkriterier analyser.
Neurosfærer utgjøres av klynger av frittflytende celler som stammer fra proliferasjon av neural stilk / progenitor-celler som vokser i nærvær av spesifikke vekstfaktorer og ikke-adhesive overflater 43, 44. Neurosfærer tjener som viktig in vitro kulturmodeller for å studere neuralstamceller / forløperceller i normal utvikling og sykdom 31, 45, 46, 47. Her beskriver vi en neurosfære basert assay for dyrking av nervestamceller / forløperceller og for differensiering til neuroner / gliaceller. Vi legger spesielt vekt trafikkering av signalisering komponenter til cilia av neuralstamceller / forløperceller og differensierte neuroner (figur 1). I motsetning til dyrking av primære nerveceller, primære neurosfærer er relativt enkle å kultur, er mottagelig for flere passasjer og fryse-tine-sykluser, og kan gjennomgå differensiering til neuroner / gliaceller. Viktigere, fant vi ut at neurosfære-avledet nervestilk / forløperceller og differensierte neuroner cilierte i kultur og lokalisere signalmolekyler som er relevante for ciliær funksjon i disse avdelinger. Neurosfære-baserte dyrkingsmetoder kan tjene som en ideell modellsystem for å studere ciliogenesis og ciliare handel med NSCs og differensierte neuroner.
Her beskriver vi en metode for å generere og vedlikeholde neurosfærekulturer fra voksen mus SVZ. Noen relevante punkter i forbindelse med kulturer er som følger. Først størrelsene av kulene er typisk mellom 50 til 200 um. I vår erfaring, når en neurosfæren blir større enn 300 mikrometer i diameter, har det optimale tidspunktet for aging vært savnet. Disse større kuler inneholder døde celler i kjernen. For det andre, som neurosfærer blir ofte brukt til å studere neuralstamceller / progenitor-celler, er det …
The authors have nothing to disclose.
Work in S.M.’s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).
12 mm round cover glass | Fisherbrand | 12-545-80 | |
24 well plate | Falcon | 353047 | |
4 % paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
50 ml tube | Falcon | 352098 | |
95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid | Fisherbrand | FB0875714G | 10 cm dish |
70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-545-152 | Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody |
Arl13B, Clone N295B/66 | Neuromab | AB_11000053 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504001 | B27 |
Centrifuge | Thermo scientific | ST 40R | |
Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
DAPI | Sigma | D9542-10MG | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancrease | Sigma | D5025-15KU | Dnase I |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418-100ML | DMSO |
Disposable Vinyl Specimen Molds | Sakura Tissue-Tek Cryomold | 4565 | 10 mm X 10 mm X 5 mm |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10×, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1408-500ML | PBS |
Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11254-20 | |
FBS | Sigma | F9026-500ML | |
Fluoromount-G solution | Southern Biotech | 0100-01 | mounting solution |
GFAP | DAKO | Z0334 | |
Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21127 | Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody |
Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21137 | Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody |
Gpr161 | home made | N/A | |
human bFGF | Sigma | F0291 | FGF |
hemocytometer | Hausser Scientific | 0.100 mm deep | improved neubauer |
Isothesia | Henry Schein | NDC 11695-0500-2 | Isofluorane |
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | Laminin |
L-Glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000 | |
Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0036 | |
N-2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | N2 |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
OCT compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | OCT |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
Recombinant human EGF protein, CF | R and D systems | 236-EG-200 | EGF |
Scissor | Fine science tools | 14060-10 | |
Superfrost plus microscope slide | Fisher scientific | 12-550-15 | slides |
Triton X | Bio-Rad | 161-0407 | |
Trypsin-EDTA solution (10X) | Sigma | T4174-100 | Trypsin |
COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile | Corning | 3471 | ultra-low binding 6 well plate |
β-tubulin III | Covance | MMS-435P | TUJ1 |