Aqui, mostramos uma abordagem enzimática para isolar hepatócitos primários a partir de ratos adultos, e descreve-se a quantificação de uma resposta inflamatória por meio de ELISA e PCR em tempo real.
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Artigo de método
A indução de uma resposta inflamatória em culturas primárias de hepatócitos de ratinhos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O fígado desempenha um papel decisivo na regulação da inflamação sistêmica. Na doença renal crónica, em particular, o fígado reage em resposta ao meio urémico, o stress oxidativo, endotoxemia e a diminuição da depuração da circulando citocinas pró-inflamatórias através da produção de um grande número de reagentes de fase aguda. ferramentas experimentais para estudar a inflamação eo papel subjacente dos hepatócitos são cruciais para compreender a regulação ea contribuição de citocinas hepáticas a uma resposta de fase aguda sistêmica e um cenário pró-inflamatória prolongada, especialmente em um ambiente complexo, tais como doença renal crónica. Uma vez que o estudo dos mecanismos complexos de inflamação in vivo permanece um desafio, uso intensivo de recursos e geralmente requer a utilização de animais transgénicos, hepatócitos isolados primários fornecer uma ferramenta robusta para obter insights mecanísticos para a resposta de fase aguda hepática. Desde esta técnica in vitro apresenta custos moderados, alta reprodutibilidade e conhecimento técnico comum, hepatócitos isolados primários podem também ser facilmente usados como uma abordagem de triagem. Aqui, nós descrevemos um método baseado em enzimática para isolar os hepatócitos primários de murino, e que descrevem a avaliação de uma resposta inflamatória nestas células usando ELISA e quantitativa PCR em tempo real.
Introdução
Doença renal crónica (IRC) pode ser definida como um estado de inflamação aguda e crónica 1. Em pacientes com DRC, os níveis séricos do fator fosfatúrico hormona de crescimento de fibroblastos 23 (FGF23) aumentará progressivamente, a fim de manter a homeostase do fosfato sérico 2. Níveis FGF23 soro aumentados estão independentemente associadas com morbidade e mortalidade cardiovascular entre os pacientes que estão começando o tratamento de hemodiálise 3, 4. Além disso, vários estudos clínicos demonstraram uma correlação entre os níveis elevados e FGF23 níveis sé....
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Protocolo
Todos os protocolos de animais e procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Miami Miller School of Medicine.
1. Preparação
- Pré-aqueça meios de perfusão hepática e fígado digerir mídia em um banho de água a 37 ° C.
- Configurar uma bomba de perfusão (30 mL / min). Cuidadosamente prefill o sistema de tubulação da bomba com a mídia perfusão hepática. Evitar as bolhas de ar no sistema e preparar o microscópio estereotáxica.
- placas de cultura de células de revestimento usando colágeno tipo I, de acordo com o protocolo do fabricante. <....
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Resultados
Histologia
As imagens de microscopia de luz representativas de células isoladas e cultivadas primárias estão representados na Figura 1A. Análise imunocitoquímica demonstra que hepatócitos isolados altamente expressar albumina (vermelho), bem como do receptor de factor de crescimento de fibroblastos 4 (FGFR4) (verde). Os núcleos são corados com 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (azul). (Figura 1B).......
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Discussão
Isolamento de hepatócitos primários a partir de ratinhos é uma ferramenta rápido, barato e fiável para estudar as respostas inflamatórias ex vivo. Se realizado corretamente, os resultados podem ser facilmente gerada e reproduzida de forma atempada e eficiente. Os seguintes pontos devem ser cuidadosamente avaliada, a fim de garantir um isolamento bem sucedido.
A incisão cirúrgica ea canulação da VCI deve ser realizada sob anestesia geral e não após a eutanásia. Um investigador jovem,.......
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Divulgações
Os autores não têm qualquer conflito de interesses a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH (R01HL128714 para CF) e (F31DK10236101 para KS) e da American Heart Association (CF e AG).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Consumíveis | |||
| Cell Strainer 70 μ m Filtro de células de nylon | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polipropileno Tubo Cônico | Falcon | 352098 | |
| 100 Aplicadores de Algodão de 6 polegadas | Seringa de Insulina Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Prato de Cultura de Tecidos 100 x 20 mm Estilo | Corning | 353003 | |
| 6 poços Cluster de Cultura de Células | Costar | 3516 | |
| 5/0 Seda Cirúrgica Trançada Preta (100 jardas) | LOOK | SP115 | |
| Nome | Company | Número de catálogo | Comentários |
| Equipamento | |||
| Minipuls 3 Bomba de perfusão | Gilson | F155007 | |
| Kits de hemacitômetro, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Óculos de cobertura de hemactómetro, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Tesouras Cirúrgicas - Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Tesoura de Íris-ToughCut Reta | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Fórceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Fórceps de Tecido de Estudante | FST | 991121-12 | |
| Nome< | strong>Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| ReagentesSolução de | |||
| ácido acético, 2.0 | N Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurano, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1.000 mg/10 mL (100 mg/mL) | VEDCO& | nbsp; 50989-161-06 | |
| Xilazina 100 mg/mL | AnaSed Injeção | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Meio de Perfusão Hepática (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Meio de Digestão do Fígado (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Suplementos Primários para Descongelamento e Plaqueamento de Hepatócitos Life Technologies | CM3000 | ||
| Life Technologies | CM4000 | ||
| Tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4 | ThermoFisher científico | 10010031 | |
| colágeno tipo 1 | Corning | 354236 | |
| solução azul de tripano | VWR | 45000-717 |
Referências
- Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
- Isakova, T., et al. Fibroblast growth f....
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Reimpressões e permissões
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