Aviær tyrestationer ved Cloacal Massage og isolering af DNA fra sæden
Summary
Denne protokol beskriver cloacal massage, en non-invasiv manuel teknik til opsamling af sæd fra fugle, og DNA-ekstraktion fra aviær sæd ved hjælp af en kommerciel udvinding kit med ændringer.
Abstract
Opsamling af sæd kan være nyttige for en bred vifte af applikationer, herunder undersøgelser, hvor sædkvalitet, sperm telomere dynamik og Epigenetik. Fugle er himmelvidt anvendte emner i biologisk forskning og er ideelle til undersøgelser der involverer gentagne sperm prøver. Men få ressourcer er i øjeblikket tilgængelig for dem, der ønsker at lære at indsamle og uddrag DNA fra aviær sperm. Her beskriver vi cloacal massage, en blid, ikke-invasiv manuel teknik til indsamling af aviær sperm. Selv om denne teknik er etableret i litteraturen, kan det være svært at lære fra de tilgængelige beskrivelser. Vi leverer også oplysninger til at udtrække DNA fra aviær sæd ved hjælp af en kommerciel udvinding kit med ændringer. Cloacal massage kan let anvendes på alle små til mellemstore mandlige fugl i reproduktiv tilstand. Efter samling, sæden kan bruges straks til motilitet assays, eller frosset til DNA-ekstraktion efter protokollen beskrevet heri. Denne ekstraktion protokol blev raffineret for aviær sperm og held har været anvendt på prøver, der opsamlet fra flere tyk arter (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanusog Turdus migratorius ) og en columbid (Columba livia).
Introduction
Fugle er ideelle temaer for undersøgelser, hvor sædkvalitet og konkurrence1, sperm telomere dynamics2, Epigenetik3og lignende emner, som de er meget udbredt i biologisk forskning og sperm nemt kan udtages ved hjælp af cloacal massage. Cloacal massage er en blid, ikke-invasiv manuel teknik til opsamling af sæd fra fugle4,5,6. Gentagne prøver kan opnås nemt og ingen særlige værktøjer er nødvendige, hvilket gør det nemt at udføre i det felt eller lab. Selv om cloacal massage har været anvendt i årtier, er det svært at lære fra de tilgængelige skrevet beskrivelser. Denne publikation er beregnet til at reducere den tid og usikkerhed, der er involveret i at lære cloacal massage.
Sæd opsamlet fra fugle ved hjælp af cloacal massage kan bruges straks til motilitet vurdering4,7 eller kunstig befrugtning8eller frosset til andre anvendelsesformål såsom avanceret billedbehandling og DNA-ekstraktion. Sæd prøver fra tyk fugle er små men indeholder tætpakkede sædceller. DNA er udvundet ved hjælp af en kommerciel udvinding kit for enkelhed, med ændringer til at overvinde de beskyttende specialfunktioner sperm9. Efter ekstraktion, kan sperm telomerer måles ved hjælp af qPCR10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en simpel og pålidelig metode til indsamling af sæd fra små og mellemstore fugle i reproduktivt aktiv tilstand, og uddrager DNA fra aviær sperm.
Beskrevet sæd DNA udvinding protokollen er ændret fra et kit for enkelhed, men blev raffineret til brug på aviær sæd. Sæd er resistente over for lysering af standard udvinding kemikalier9,13, og sæd prøver indsamlet fra spurvefugle er ret lille (typisk et par microlite…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Jose Noguera for tidlige bistand med cloacal massage, og Jeffrey Kittilson for lab støtte. Dette arbejde blev støttet af en ND EPSCoR FAR0022429 award til BJH. Udgifter blev generøst støttet af NDSU Department of Biological Sciences.
Materials
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
Referências
- Briskie, J. V., Montgomerie, R. Sperm size and sperm competition in birds. Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).
- Monaghan, P. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).
- Carrell, D. T. Epigenetics of the male gamete. Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).
- Burrows, W. H., Quinn, J. P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).
- Wolfson, A. The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds. Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).
- Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment. The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).
- Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus. Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).
- Purchase, C. F., Earle, P. T. Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data. J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).
- Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. Forensic application of DNA ‘fingerprints’. Nature. 318 (12), 577-579 (1985).
- Criscuolo, F., et al. Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres. J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).
- Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. . Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , (2016).
- . . QIAamp DNA Micro Handbook. , (2014).
- Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs. Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).
- Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler. Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).
- Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds. Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).
- Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates). Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).
- Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species. J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).
