ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים
Summary
הידבקויות פני התא הם מרכזי mechanotransduction, כפי שהם לשדר מתח מכני ליזום את מסלולי איתות מעורבים הומאוסטזיס ופיתוח רקמות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח את התהליכים הביוכימיים אשר מופעלים בתגובה מתח, באמצעות microbeads מגנטי מצופה ליגנד ויישום כוח לקולטנים הידבקות.
Abstract
מתחמי הידבקות תא משטח Mechanosensitive לאפשר לתאים לחוש את התכונות המכאניות של סביבתם. מחקרים שנעשה לאחרונה זיהו הם מולקולות חישת כוח באתרים דבקים, ואת גורמי תעתוק תלוי כוח המווסתים ביטוי גנים ספציפי שושלת ולנסוע פלטי פנוטיפי. עם זאת, רשתות איתות המרת מתח מכאני לתוך הביוכימיים נותרו חמקמקות. כדי לחקור את מסלולי האיתות עוסקים על מתח מכאני להחיל פני תא קולטן, microbeads פאראמגנטי ניתן להשתמש. כאן אנו מציגים פרוטוקול באמצעות חרוזים מגנטיים להחיל כוחות לחלבונים דבקים פני תא. בגישה זו, אפשר לחקור מסלולי איתות ציטופלסמית כוח תלוי רק לא על ידי גישות ביוכימיות שונות, אלא גם שיפוץ הידבקות על ידי בידוד מגנטי של מתחמי הידבקות מצורפים החרוזים מצופים ליגנד. פרוטוקול זה כולל הכנת שיתוף ליגנדחרוזי פאראמגנטי ated, ואת היישום של להגדיר כוחות מתיחים ואחריו ניתוחים ביוכימיים. בנוסף, אנו מספקים מדגם מייצג של נתונים הוכחת מתח שחל על הידבקות מבוססת integrin מפעיל שיפוץ הידבקות ומשנת זירחון החלבון טירוזין.
Introduction
בשנת metazoa, מתח מכני מכוון התפתחות רקמת הומאוסטזיס באמצעות הסדרת מספר עצום של תהליכים תאיים כגון התפשטות, בידול הישרדות 1, 2. מתח מכאני יכול לנבוע מטריקס או יכול להיוצר על ידי תאים חסידים, אשר מדגם הסביבה התאית שלהם באמצעות מכונות התכווצות actomyosin שמושכות אל תאי מטריקס וזונדים הנוקשים שלה באמצעות מולקולות מתח רגיש. בתגובת מתח, חלבוני הידבקות mechanosensitive לעבור שינויים מרחביים המפעילים מפלי איתות מורכבים. בתורו, מסלולי איתות אלה לתזמר mechanoresponse מקיף התפשטות, בידול והישרדות אשר מתאים את ההתנהגות הסלולר לסביבה התאית. ניתן ליישבם תהליכים כאלה בתוך פרק זמן קצר טווח (שניות עד דקות) להאכיל בחזרה במהירות אל הלולאה של מכה notransduction ידי שינוי מבני mechanosensitive. למשל, הידבקויות מבוססי integrin לחזק בתגובה מתח דרך שיפוץ cytoskeletal בתיווך GTPase Rho 3, 4, 5. במקביל, מסלולי איתות אחרים מופעלים על שעות וימים לשלוט תכנות גנטי כי בסופו של דבר להשפיע תא גורל 6. בעוד מחקרים רבים הדגישו את השפעת נוקשות מטריקס על דטרמיניזם תא ומחלות פיתוח 1, 2, המנגנונים המולקולריים המדויקים של mechanotransduction בתיווך ההידבקות עדיין להישאר חמקמקים.
גישות שונות פותחו כדי לחקור את ההשפעות של כוחות שנוצר תא או כוחות חיצוניים על התנהגות תא, כוללים מערכות זרימה, העברת אנרגית תהודת קרינת חיישני -tension (סריג) 7,ילדה = "Xref"> 8, תואם מצעים 9, פינצטה המגנטית, פינצטה אופטית 10 ו במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) 11. כאן אנו מציגים פרוטוקול באמצעות חרוזי פאראמגנטי לאפיין מסלולי mechanotransduction בתגובת כוחות tensional להחיל קולטנים הידבקות ספציפיים. חרוזי פאראמגנטי הם חלקיקים כי הפיך למגנט כאשר הניחו שדה מגנטי. לאחר מצופה ליגנד עבור קולטן מסוים, חרוזים אלה מספקים כלים רבים עצמה כדי לחקור את ההשפעות של יישום כוח תאי. שיטה זו תאומת על ידי מספר מחקרים 3, 5, 12 – 17 מציגה את היתרון כדי להקל על ניתוח ביוכימיים בעיקר על תאים חסידים. באמצעות חרוזים מגנטיים דומים מצופה קולגן ואחריו ניתוח ביוכימיים, עבודה מוקדמת דיווחה על עלייהזירחון החלבון טירוזין ו RhoA ההפעלה בתגובה מתח 5, 18, 19. השיטה המתוארת להלן שמשה גם עם פיברונקטין (FN) חרוזים מצופים לאפיין את מסלולי האיתות במורד זרם המתח להחיל integrins 3. במחקר זה, Guilluy et al. המתח עולה כי מפעיל RhoA באמצעות גיוס של הגורמים החליפין נוקלאוטיד שני גואנין (GEFs), LARG ואת GEF-H1, לקומפלקסים הידבקות integrin. מאז, מחקרים אחרים הראו כי GEF-H1 מגויסת לקומפלקסים דבקים בתגובת מתח תא שנוצר באמצעות שיטות שונות 20, 21, הוכחת את החוסן של המתודולוגיה המתוארת כאן. כתוצאה מכך, מופעל RhoA הוצגה לקדם חיזוק הידבקות, דרך שיפוץ cytoskeletal. מערכת זו גם שמשה לחקור מיושם מתח to קולטנים הידבקות תא / תא. יישום של כוחות על חרוזים מגנטיים צופה עם התחום התאי של E-cadherin שהגדיל גיוס vinculin בדומה מתחמי ההידבקות קשור integrin 12. קולינס ועמיתיו ציינו כי יישום של מתח PECAM-1 מקדם integrin ו RhoA הפעלת 13. גישה נוספת ניסיוני באמצעות חרוזים מגנטיים היא חקר מתח להחיל גרעינים בודדים. באמצעות חרוזים מצופים עם נוגדנים כנגד חלבון מעטפת הגרעין nesprin-1, מתחמי מעטפת הגרעין היו מטוהרים כדי להראות שהם מוסדרים באופן דינמי בתגובה מתח מכני 22. תוצאות אלו תומכות האדירות של שיטה זו בחקר מסלולי mechanotransduction. יתר על כן, בעוד מערכות זרימה או כוח המתיחה לעורר תהליכים תאיים כלליים, חרוזים מגנטיים שמתמקדים קולטן הידבקות תא באמצעות אחת הליגנדים קולטן <sup class = "Xref"> 3 או נוגדנים חד שבטיים נגד לקולטן תא 13, 15.
יתרון נוסף של שיטה זו הוא הבידוד של מתחמי הידבקות באמצעות הליך טיהור זיקה ליגנד פשוט. עובדה ידועה היא כי תוספת של חרוזים מצופים ליגנד לתאים נקשר לקולטנים הידבקות ומשרה את הגיוס של חלבונים הידבקות מספר 23. בקשה נוספת של כוחות כדי חרוזים מגנטיים צופה ליגנד הופכת מתחמי הידבקות אלה לתוך פלטפורמות macromolecular שמתווכים מסלולי איתות מתח תלוי שונים 4, 24. Cell תמוגה ואחריו ריכוז חרוז באמצעות מגנט מתיר את בידודה של פלטפורמות הידבקות. שיטות אחרות להשתמש בהם כדי לטהר מתחמי הידבקות כבר שימשו תאים חסיד. הם משלבים crosslinking כימי כדי לחסוך אינטראקציות בין חלבוניםו צעד תמוגה התא על ידי חומר ניקוי ותזרים גזירה או sonication 20, 21, 25, 26, 27, 28. השלב האחרון הוא האוסף של ממברנות פלזמת גחון וכתוצאה המכילות את מתחמי ההידבקות. בניגוד לשיטות אלה, חרוזים מגנטיים לאפשר רמת טיהור גדולה של מתחמי הידבקות תא על ידי מיקוד סלקטיבי מש' מסוימת של קולטנים הידבקות. חרוזים מגנטיים כבר להשתמש בהם כדי לטהר מתחמי הידבקות תאים שאינם חסיד המצורפת microbeads מצופה ליגנד 29, 30. השיטה המתוארת להלן מחק מצבים ביולוגיים שבו כוח מוחל לתקופה ממושכת קצרה (שניות עד דקות). לכן, זה מספק כלי רב עצמה על החקירה היא את ההרכב המולקולרי של מתחמי הידבקות מטוהריםמסלולי mechanosensitive-איתות במורד הזרם.
כאן אנו מציגים פרוטוקול ניסוי מפורט באמצעות חרוזים מגנטיים להחיל כוחות tensional לחלבוני משטח דבק. מגנט ניאודימיום קבע מושם על גבי משטח תרבות הצלחת. פן המוט של המגנט הוא ממוקם בגובה של 6 מ"מ כך שהכח על חרוז מגנטי יחיד 2.8 מיקרומטר הוא קבועים (כ 30-40 pN) 31. משך גירוי מתח נקבע על ידי המפעיל בהתאם המולקולה של ריבית בקנה המידה בעת ההפעלה שלה. תאים הם סוף סוף lysed, מתחמי הידבקות הם מטוהרים על ידי פרדת חרוזים באמצעות מגנט וניתוחי ביוכימיים מעובדים. פרוטוקול זה כולל הכנת חרוזים פאראמגנטי מצופה ליגנד, ואת היישום של מתח באמצעות מגנט ואחריו ניתוחים ביוכימיים. בנוסף, אנו מספקים מדגם מייצג של נתונים הוכחת מתח להחיל ADH מבוסס integrinesions גורם שיפוץ הידבקות ומשנת זירחון החלבון טירוזין.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כאן מהווה גישה פשוטה ליישם מתח לקולטנים הדבקה פני תא ולאפשר הטיהור הבאה שלהם. עם זאת, כמה צעדים חיוניים כדי לבצע טיהור הדבקה יעילה אופטימיזציה פוטנציאלי יכולים להיעשות בהתאם קולטנים הידבקות הממוקדות. אנו מציגים בעיות פוטנציאליות המשתמש עלול להיתקל בה?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CG נתמך על ידי תרומות של סוכנות הידיעות הלאומית de la משוכלל ונדיר (ANR-13-JSV1-0008), מתוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (n˚8304162 אינטגרציה מארי קירי קריירה) ומן המועצה האירופית למחקר (ERC) תחת אופק של האיחוד האירופי 2020 מחקר תוכנית חדשנות (n˚639300 גרנט המוצא ERC).
Materials
| Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
| Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
| Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
| DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
| 60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |
Referências
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. . Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).
- Guilluy, C., et al. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).
- Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels. J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).
- Zhao, X. -. H., et al. Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway. J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells. Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. l. . Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells. Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).
- Bays, J. L., et al. Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions. J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).
- Collins, C., et al. Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway. Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).
- Gordon, W. R., et al. Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch. Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).
- Lessey-Morillon, E. C., et al. The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration. J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).
- Osborne, L. D., et al. TGF-β regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion. Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).
- Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF. Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).
- Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts. Am J Physiol – Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).
- Glogauer, M., et al. Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching. J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).
- Kuo, J. -. C., Han, X., Hsiao, C. -. T., Yates, J. R., Waterman, C. M. Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for β-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation. Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).
- Schiller, H. B., et al. β1- and αv-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments. Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).
- Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex. Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).
- Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio, ., A, M. P., Sheetz, Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).
- Ajeian, J. N., et al. Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells. Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).
- Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome. Exp Cell Res. , (2015).
- Jones, M. C., et al. Isolation of integrin-based adhesion complexes. Curr Protoc Cell Biol. 66, 9.8.1-9.8.15 (2015).
- Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Frémillon, A., Humphries, M. J. Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition. PloS One. 9 (12), e115213 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of integrin adhesion complexes. Sci Sign. 4 (167), pt2 (2011).
- Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of α4β1 integrin adhesion complexes reveals α-subunit-dependent protein recruitment. Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).
- Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells. Methods. , (2015).
- Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation. J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).
- Sawada, Y., Sheetz, M. P. Force transduction by Triton cytoskeletons. J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).
- Grinnell, F., Geiger, B. Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization. Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).
- Schroeder, F., Kinden, D. A. Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads. J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
- Seo, D., et al. A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time. Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).
