تحليل الخلايا السطحية التصاق إعادة عرض في الاستجابة للتوتر الميكانيكية باستخدام الخرز المغناطيسي
Summary
التصاقات سطح الخلية هي المركزية في mechanotransduction، كما نقل التوتر الميكانيكية والشروع في مسارات الإشارات المشاركة في توازن الأنسجة والتنمية. هنا، نقدم بروتوكول لتشريح المسارات البيوكيميائية التي يتم تفعيلها في فعل للتوتر، وذلك باستخدام ميكروبيدات المغناطيسي المغلفة يجند وتطبيق قوة لمستقبلات الالتصاق.
Abstract
المجمعات التصاق سطح الخلية Mechanosensitive يسمح للخلايا لاستشعار الخصائص الميكانيكية للمحيطهم. وقد حددت الدراسات الحديثة على حد سواء جزيئات الاستشعار القوة في مواقع الالتصاق، وعوامل النسخ التي تعتمد على القوة التي تنظم التعبير الجيني النسب المحددة ودفع مخرجات المظهرية. ومع ذلك، ظلت شبكات الإشارات تحويل التوتر الميكانيكية في الممرات الحيوية بعيد المنال. لاستكشاف مسارات الإشارات تعمل على التوتر الميكانيكية المطبقة على مستقبلات سطح الخلية، ميكروبيدات مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic يمكن استخدامها. هنا نقدم بروتوكول لاستخدام حبات مغناطيسية لتطبيق قوى للبروتينات التصاق سطح الخلية. باستخدام هذا النهج، فمن الممكن للتحقيق ليس فقط مسارات الإشارات هيولي التي تعتمد على القوة من قبل النهج البيوكيميائية المختلفة، ولكن أيضا إعادة عرض التصاق بواسطة العزلة المغناطيسية المجمعات الالتصاق تعلق حبات المغلفة يجند. ويشمل هذا البروتوكول إعداد يجند المشتركATED الخرز مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic، وتطبيق تحدد قوات الشد تليها التحليلات الكيميائية الحيوية. بالإضافة إلى ذلك، ونحن نقدم عينة تمثيلية من البيانات مما يدل على أن التوتر تطبيقها على التصاق القائم على إنتغرين مشغلات التصاق إعادة عرض ويغير البروتين التيروزين الفسفرة.
Introduction
في metazoa والتوتر الميكانيكية يوجه تطوير الأنسجة والتوازن خلال تنظيم عدد لا يحصى من عمليات الخلوية مثل انتشار الأسلحة النووية، والتمايز والبقاء على قيد الحياة 1 و 2. التوتر الميكانيكية يمكن أن تنشأ من المصفوفة خارج الخلية أو يمكن أن تتولد من قبل الخلايا الملتصقة، التي عينة بيئة خارج الخلية من خلال آلية مقلص أكتوميوزين التي تشد على المصفوفة خارج الخلية و المسابير صلابة من خلال جزيئات والتوتر الحساسة. وردا على التوتر والبروتينات التصاق mechanosensitive تخضع التغييرات متعلق بتكوين التي تؤدي شلالات الإشارات المعقدة. في المقابل، هذه المسارات يشير تنسق mechanoresponse تشمل الانتشار، والتمايز والبقاء على قيد الحياة أن يضبط السلوك الخلوي للبيئة خارج الخلية. هذه العمليات يمكن تسويتها في فترة زمنية قصيرة الأجل (ثواني إلى دقائق) لتغذية بسرعة مرة أخرى على حلقة من ميكا notransduction عن طريق تعديل الهياكل mechanosensitive. على سبيل المثال، التصاقات القائم على إنتغرين تعزز ردا على التوتر من خلال توسط GTPase-رو هيكل الخلية إعادة عرض 3، 4، 5. في موازاة ذلك، يتم تفعيل مسارات إشارات أخرى خلال الساعات والأيام للسيطرة على برامج الوراثية التي تؤثر في نهاية المطاف خلية مصير 6. في حين أن العديد من الدراسات قد سلط الضوء على تأثير تصلب مصفوفة على الحتمية الخلية وتطور المرض 1، 2، الآليات الجزيئية الدقيقة للmechanotransduction بوساطة الالتصاق لا يزال بعيد المنال.
وقد تم تطوير مناهج مختلفة لدراسة تأثيرات القوى المولدة خلية أو القوى الخارجية على سلوك الخلية، بما في ذلك نظم تدفق ونقل مضان الطاقة الرنين (الحنق) أجهزة الاستشعار -tension 7،معشوقة = "XREF"> 8، ركائز متوافقة 9، ملاقط المغناطيسية، ملاقط بصرية 10 و مجهر القوة الذرية (AFM) 11. هنا نقدم بروتوكول باستخدام الخرز مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic لتوصيف مسارات mechanotransduction استجابة لقوى المتوترة تطبيقها على مستقبلات الالتصاق محددة. حبات مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic هي الجزيئات التي جذب عكسية عند وضعها في مجال مغناطيسي. مرة واحدة المغلفة مع يجند لمستقبلات محددة، وتوفر هذه الخرز أداة قوية لدراسة آثار تطبيق قوة خارج الخلية. وقد تم التحقق من صحة هذه الطريقة من قبل العديد من الدراسات 3، 5، 12-17 ويقدم ميزة لتسهيل تحليل الكيمياء الحيوية إلى حد كبير على الخلايا الملتصقة. باستخدام الخرز المغناطيسي المغلفة الكولاجين مماثلة تليها تحليل الكيمياء الحيوية، وذكر العمل في وقت مبكر زيادة فيبروتين تيروزين الفسفرة وتفعيل RhoA ردا على التوتر 5، 18، 19. كما تم استخدام الأسلوب هو موضح أدناه مع فبرونيكتين (FN) الخرز المغلفة لتوصيف مسارات إشارات المصب من التوتر تطبق على integrins 3. في هذه الدراسة، Guilluy وآخرون. أظهرت أن التوتر ينشط RhoA من خلال تعيين اثنين من العوامل الصرف جوانين النوكليوتيدات (GEFs)، LARG ومرفق البيئة العالمية-H1، إلى المجمعات التصاق إنتغرين. ومنذ ذلك، أظهرت دراسات أخرى أن GEF-H1 يتم تجنيده لالمجمعات الالتصاق ردا على التوتر ولدت الخلية باستخدام أساليب مختلفة 20، 21، مما يدل على متانة المنهجية الواردة هنا. ونتيجة لذلك، فقد تبين RhoA تفعيلها لتعزيز التصاق التعزيز، من خلال إعادة تشكيل هيكل الخلية. وقد استخدم هذا النظام أيضا لاستكشاف التوتر تطبيقها رس مستقبلات الخلايا / التصاق الخلية. تطبيق القوات على حبات مغناطيسية المغلفة مع المجال خارج الخلية من E-كادهيرين الناجم عن زيادة في التوظيف فينكولين على نحو مماثل لإنتغرين المرتبطة المجمعات التصاق 12. ولاحظ كولينز وزملاؤه أن تطبيق التوتر PECAM-1 يشجع إنتغرين وتفعيل RhoA 13. المنهج التجريبي آخر باستخدام الخرز المغناطيسي هو دراسة التوتر تطبيقها على نواة معزولة. باستخدام حبات مغلفة مع أجسام مضادة ضد بروتين الغلاف النووي nesprin-1، وتنقية المجمعات المغلف النووية أن تظهر أنها تنظم حيوي في استجابة للتوتر الميكانيكية 22. وتدعم هذه النتائج تتحول القوة من هذه الطريقة في دراسة مسارات mechanotransduction. وعلاوة على ذلك، في حين نظم تدفق أو قوة الجر تحفز العمليات الخلوية العامة، الخرز المغناطيسي تستهدف على وجه التحديد مستقبلات التصاق الخلية باستخدام إما بروابط مستقبلات <suص الطبقة = "XREF"> 3 أو الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد مستقبلات سطح الخلية 13 و 15.
ميزة أخرى لهذه الطريقة هي عزلة المجمعات الالتصاق من خلال إجراء تنقية تقارب يجند مباشرة. ومن المعروف أن إضافة حبات المغلفة يجند للخلايا تربط مستقبلات الالتصاق ويستحث تجنيد العديد من البروتينات التصاق 23. تطبيق مزيد من القوات إلى حبات مغناطيسية المغلفة يجند يتحول هذه المجمعات التصاق إلى منصات الجزيئات التي تتوسط المختلفة التي تعتمد على التوتر مسارات الإشارات 4، 24. تحلل الخلية تليها تركيز حبة باستخدام مغناطيس يسمح عزل منصات التصاق. وقد تم بالفعل استخدام أساليب أخرى تستخدم في تنقية المجمعات الالتصاق في الخلايا الملتصقة. فهي تجمع بين يشابك الكيميائية للحفاظ على تفاعلات البروتين البروتينوخطوة خلية تحلل من المنظفات وتدفق القص أو صوتنة 20، 21، 25، 26، 27، 28. والخطوة الأخيرة هي جمع ينتج عن ذلك من أغشية البلازما البطنية التي تحتوي على مجمعات التصاق. وخلافا لهذه الأساليب، حبات مغناطيسية تسمح بمستوى تنقية أكبر المجمعات التصاق الخلية من خلال استهداف انتقائي عائلة محددة من مستقبلات الالتصاق. وقد تم بالفعل استخدام الخرز المغناطيسي لتنقية المجمعات الالتصاق في الخلايا غير ملتصقة تعلق على ميكروبيدات المغلفة يجند 29، 30. الأسلوب هو موضح أدناه الحالات البيولوجية يقلد حيث يتم تطبيق قوة لفترة طويلة قصيرة (ثواني إلى دقائق). ولذلك، فإنه يوفر أداة قوية للتحقيق في كل من التركيب الجزيئي للمجمعات التصاق تنقيته ومسارات المصب يشير mechanosensitive.
هنا نقدم بروتوكول تجريبي مفصل لاستخدام حبات مغناطيسية لتطبيق القوات المتوترة للبروتينات سطح الالتصاق. يتم وضع مغناطيس النيوديميوم دائم على الجزء العلوي من سطح الطبق الثقافة. يتم وضع وجهه قطب المغناطيس على ارتفاع 6 مم بحيث القوة على 2.8 ميكرومتر حبة المغناطيسي واحد هو ثابت (حوالي 30-40 السندات الإذنية) 31. يتم تحديد مدة التحفيز التوتر من قبل المشغل اعتمادا على جزيء من الفوائد ولها على نطاق ووقت التنشيط. وهي lysed الخلايا أخيرا، يتم تنقية المجمعات التصاق بواسطة فصل حبات باستخدام مغناطيس وتتم معالجة التحليلات الكيميائية الحيوية. ويشمل هذا البروتوكول إعداد حبات مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic المغلفة يجند، وتطبيق التوتر من خلال المغناطيس تليها التحليلات الكيميائية الحيوية. بالإضافة إلى ذلك، ونحن نقدم عينة تمثيلية من البيانات مما يدل على أن التوتر تطبيقها على معاذ القائم على إنتغرينesions يدفع التصاق إعادة عرض ويغير البروتين التيروزين الفسفرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الموصوفة هنا يشكل نهجا واضحة لتطبيق التوتر لمستقبلات الالتصاق سطح الخلية والسماح تنقية لاحقا. ومع ذلك، بعض الخطوات الهامة لأداء كفاءة تنقية التصاق وتحسين محتمل يمكن أن يتم اعتمادا على المستقبلات التصاق المستهدفة. نقدم المشاكل المحتملة التي قد يواجهها المس?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم الفريق الاستشاري من المنح المقدمة من الوكالة الوطنية للبحوث (وكالة الاستخبارات الوطنية-13-JSV1-0008)، من البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (ماري كوري التكامل الوظيفي n˚8304162) ومن مجلس الأبحاث الأوروبي (ERC) تحت الأفق الاتحاد الأوروبي 2020 البحوث والابتكار برنامج (ERC ابتداء غرانت n˚639300).
Materials
| Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
| Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
| Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
| DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
| 60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |
Referências
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. . Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).
- Guilluy, C., et al. The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins. Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).
- Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels. J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).
- Zhao, X. -. H., et al. Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway. J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells. Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. l. . Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells. Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).
- Bays, J. L., et al. Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions. J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).
- Collins, C., et al. Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway. Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).
- Gordon, W. R., et al. Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch. Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).
- Lessey-Morillon, E. C., et al. The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration. J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).
- Osborne, L. D., et al. TGF-β regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion. Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).
- Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF. Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).
- Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts. Am J Physiol – Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).
- Glogauer, M., et al. Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching. J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).
- Kuo, J. -. C., Han, X., Hsiao, C. -. T., Yates, J. R., Waterman, C. M. Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for β-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation. Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).
- Schiller, H. B., et al. β1- and αv-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments. Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).
- Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex. Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).
- Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio, ., A, M. P., Sheetz, Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).
- Ajeian, J. N., et al. Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells. Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).
- Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome. Exp Cell Res. , (2015).
- Jones, M. C., et al. Isolation of integrin-based adhesion complexes. Curr Protoc Cell Biol. 66, 9.8.1-9.8.15 (2015).
- Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Frémillon, A., Humphries, M. J. Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition. PloS One. 9 (12), e115213 (2014).
- Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of integrin adhesion complexes. Sci Sign. 4 (167), pt2 (2011).
- Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. Proteomic analysis of α4β1 integrin adhesion complexes reveals α-subunit-dependent protein recruitment. Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).
- Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells. Methods. , (2015).
- Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation. J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).
- Sawada, Y., Sheetz, M. P. Force transduction by Triton cytoskeletons. J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).
- Grinnell, F., Geiger, B. Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization. Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).
- Schroeder, F., Kinden, D. A. Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads. J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
- Seo, D., et al. A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time. Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).
