Cell overflade sammenvoksninger er centrale i mechanotransduction, da de sender mekanisk spænding og indlede signalveje involveret i vævshomeostase og udvikling. Her præsenterer vi en protokol for at dissekere de biokemiske veje, der aktiveres som reaktion på spænding, ved hjælp af ligand-overtrukne magnetiske mikrokugler og force ansøgning til vedhæftning receptorer.
Mekanosensitive celleoverflade adhæsionskomplekser tillader celler at fornemme de mekaniske egenskaber af deres omgivelser. Nylige undersøgelser har identificeret både kraft-sensing molekyler ved vedhæftning sites, og kraft-afhængige transkriptionsfaktorer, der regulerer slægt-specifikke genekspression og drive fænotypiske udgange. Imidlertid har de signalering netværk konvertere mekanisk spænding i biokemiske veje været undvigende. At udforske de signalveje beskæftiget ved mekanisk spænding påføres celleoverfladereceptor, kan superparamagnetiske mikroperler anvendes. Her præsenterer vi en protokol til at bruge magnetiske perler til at anvende styrker til celleoverfladen adhæsionsproteiner. Ved anvendelse af denne fremgangsmåde, er det muligt at undersøge ikke eneste kraft-afhængig cytoplasmatisk signalveje fra forskellige biokemiske metoder, men også adhæsion remodellering ved magnetisk isolering af adhæsionskomplekser knyttet til ligand-coatede perler. Denne protokol omfatter udarbejdelse af ligand-coerede superparamagnetiske perler og anvendelse af definere trækkræfter efterfulgt af biokemiske analyser. Derudover tilbyder vi et repræsentativt udsnit af data, der viser, at spændingen anvendes på integrin-baserede vedhæftning udløser vedhæftning remodellering og ændrer proteintyrosinphosphorylering.
I Metazoa, mekanisk spænding dirigerer væv udvikling og homeostase gennem regulering af et utal af cellulære processer såsom proliferation, differentiering og overlevelse 1, 2. Mekaniske spænding kan opstå fra den ekstracellulære matrix eller kan genereres ved adhærente celler, som prøven deres ekstracellulære miljø gennem actomyosin kontraktile maskiner, der trækker på ekstracellulær matrix og prober sin stivhed gennem spændinger følsomme molekyler. Som reaktion på spænding, mekanosensitive adhæsionsproteiner undergå konformationsændringer der udløser komplekse signalleringskaskader. Til gengæld er disse signalveje iscenesætte en mechanoresponse omfatter proliferation, differentiering og overlevelse, der justerer cellulær adfærd til det ekstracellulære miljø. Sådanne processer kan afvikles i en kortvarig periode (sekunder til minutter) til hurtigt at fodre tilbage på løkke af mecha notransduction ved at ændre de mekanosensitive strukturer. For eksempel integrin-baserede adhæsioner styrke i afhængighed af spændingen gennem Rho GTPase-medieret cytoskeletal remodeling 3, 4, 5. Samtidig er andre signalveje aktiveret i løbet af timer og dage at kontrollere genetiske programmer, der i sidste ende påvirke celle skæbne 6. Betragtninger, har mange undersøgelser fremhævet effekten af matrix stivhed på celle determinisme og sygdom udvikling 1, 2, de præcise molekylære mekanismer i vedhæftning-medieret mechanotransduction stadig undvigende.
Der er udviklet forskellige metoder til at undersøge virkningerne af celle-genereret kræfter eller eksterne kræfter på celle adfærd, herunder flow-systemer, fluorescens resonans (FRET) -tension sensorer 7,lass = "xref"> 8, kompatible substrater 9, magnetiske pincet, optisk pincet 10 og atomic force mikroskopi (AFM) 11. Her præsenterer vi en protokol ved hjælp superparamagnetiske perler til at karakterisere mechanotransduction veje som reaktion på trækkræfter anvendes til specifikke vedhæftning receptorer. Superparamagnetiske perler er partikler, der reversibelt magnetize når den placeres i et magnetisk felt. Når belagt med en ligand for en specifik receptor, disse perler er et effektivt værktøj til at undersøge virkningerne af ekstracellulær kraftpåvirkning. Denne metode er blevet valideret af flere undersøgelser 3, 5, 12 – 17 og præsentere fordel at stort set lette biokemisk analyse på klæbende celler. Under anvendelse af lignende collagen-coatede magnetiske perler efterfulgt af biokemisk analyse, tidlige arbejde rapporteret en stigning iproteintyrosinphosphorylering og RhoA aktivering som respons på spænding 5, 18, 19. Den nedenfor beskrevne fremgangsmåde er også blevet anvendt med fibronectin (Fn) overtrukne perler til at karakterisere de signalveje nedstrøms fra spændinger påført integriner 3. I denne undersøgelse Guilluy et al. viste, at spændinger aktiverer RhoA gennem ansættelse af de to guanin nukleotid exchange faktorer (GEFs), Larg og GEF-H1, til integrin vedhæftning komplekser. Siden da, har andre undersøgelser vist, at GEF-H1 rekrutteres til vedhæftning komplekser som reaktion på celle-genereret spænding ved hjælp af forskellige metoder 20, 21, viser robustheden af metoden beskrevet her. Som følge heraf blev aktiveret RhoA vist at fremme adhæsion forstærkning, gennem cytoskeletal remodeling. Dette system blev også anvendt til at undersøge spænding, der påføres to celle / celleadhæsionsreceptorer. Anvendelse af kræfter på magnetiske perler overtrukket med det ekstracellulære domæne af E-cadherin inducerede en forøgelse af vinculin rekruttering lighed med integrin associeret adhæsionskomplekser 12. Collins og kolleger observeret, at anvendelsen af spænding til PECAM-1 fremmer integrin og RhoA aktivering 13. En anden eksperimenterende tilgang med magnetiske perler er studiet af spænding anvendes på isolerede kerner. Brug af perler overtrukket med antistoffer mod nukleare kappeproteinet nesprin-1 blev envelope komplekser nukleare oprenset for at vise, at de dynamisk reguleres som respons på mekanisk spænding 22. Disse resultater understøtter powerfulness af denne metode i studiet af mechanotransduction pathways. Desuden mens flow eller trækkraft systemer stimulere generelle cellulære processer, magnetiske perler specifikt retter sig mod en celle vedhæftning receptor ved hjælp af enten ligander <sup class = "xref"> 3 eller monoklonale antistoffer mod celleoverfladereceptor 13, 15.
En anden fordel ved denne fremgangsmåde er isolering af adhæsionskomplekser gennem en enkel ligandaffinitet oprensningsprocedure. Det er velkendt, at tilsætning af ligand-coatede perler til celler binder adhæsionsreceptorer og inducerer rekruttering af flere adhæsionsproteiner 23. Yderligere anvendelse af kræfter til ligand-coatede magnetiske perler forvandler disse vedhæftning komplekser i makromolekylære platforme, der formidler forskellige spændinger-afhængige signalveje 4, 24. Cellelyse efterfulgt af perle koncentration på en magnet tillader isoleringen af vedhæftning platforme. Andre metoder, der anvendes til at oprense adhæsionskomplekser er allerede blevet anvendt i adhærente celler. De kombinerer kemisk tværbinding for at bevare protein-protein interaktionerog en celle lysis trin vaskemiddel og shear flow eller lydbehandling 20, 21, 25, 26, 27, 28. Det sidste trin er en samling af de resulterende ventrale plasmamembraner indeholder adhæsionskomplekser. I modsætning disse metoder, magnetiske perler tillader en større rensning niveau af celleadhæsion komplekser ved selektivt at målrette en specifik familie af adhæsionsreceptorer. Magnetiske perler er allerede blevet anvendt til at oprense adhæsionskomplekser i ikke-adhærente celler bundet til ligand-coatede mikroperler 29, 30. Den nedenfor beskrevne efterligner biologiske situationer metode, hvor kraft påføres i en kort længere periode (sekunder til minutter). Derfor giver det et stærkt værktøj til at undersøge både den molekylære sammensætning af oprensede adhæsionskomplekser ogdownstream mekanosensitive-signalveje.
Her præsenterer vi en detaljeret forsøgsprotokol for at bruge magnetiske perler til at anvende trækkræfter vejgreb overfladeproteiner. En permanent neodym magnet placeres oven på dyrkningsskålen overflade. Polfladen af magneten er placeret i en højde på 6 mm, således at kraften på et enkelt 2,8 um magnetisk perle er konstant (ca. 30-40 pn) 31. Varigheden af spænding stimulation bestemmes af operatøren afhængigt af molekylet af interesse og dens tidsplan for aktivering. Celler endelig lyseres, adhæsionskomplekser oprenses ved perler separation under anvendelse af en magnet og biokemiske analyser behandles. Denne protokol omfatter udarbejdelse af ligand-coatede superparamagnetiske perler, og anvendelsen af spænding gennem magnet efterfulgt af biokemiske analyser. Derudover tilbyder vi et repræsentativt udsnit af data, der viser, at spændingen anvendes på integrin-baserede adhesions inducerer vedhæftning remodellering og ændrer proteintyrosinphosphorylering.
Den her beskrevne fremgangsmåde er en enkel tilgang til at anvende spænding til celleoverflade adhæsionsreceptorer og tillade deres efterfølgende oprensning. Men nogle trin er afgørende for at udføre en effektiv vedhæftning rensning og potentiel optimering kan gøres afhængig af de målrettede adhæsionsreceptorer. Vi præsenterer potentielle problemer brugeren kan støde nedenfor.
Vi anvendte 2,8 um diameter magnetiske perler, men større perler kan anvendes, såsom 4,5 um diameter….
The authors have nothing to disclose.
CG er støttet af tilskud fra Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), fra EU syvende rammeprogram (Marie Curie Career Integration n˚8304162) og fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU 's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram (ERC Starting Grant n˚639300).
Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |