자석 구슬을 사용하여 기계 인장에 대한 응답으로 세포 표면 접착 리모델링 분석
Summary
이들은 기계적 장력 송신 조직 항상성 및 개발에 관여하는 신호 전달 경로를 시작으로 세포 표면 유착은 mechanotransduction 중앙이다. 여기서는 리간드 피복 된 자성 마이크로 비드 접착 수용체 포스 응용 프로그램을 사용하여, 인장에 응답하여 활성화되는 생화학 적 경로를 해부위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
Mechanosensitive 세포 표면 접착 착물 셀들은 주변의 기계적 특성을 감지 할 수있다. 최근의 연구는 접착 부위에 힘을 감지 분자 및 혈통 특정 유전자 발현을 조절하고 표현형 출력을 구동 힘에 의존하는 전사 인자를 모두 확인했다. 그러나, 생화학 적 경로에 기계적인 긴장을 변환 신호 네트워크는 애매 남아있다. 세포 표면 수용체에 적용된 기계적 장력에 종사하는 신호 전달 경로를 탐색하기 위해, 초상 자성 마이크로 비즈가 사용될 수있다. 여기서 우리는 세포 표면의 접착 단백질의 힘을 적용하는 자성 비드를 이용하기위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법을 사용하면, 리간드 피복 된 비드에 부착 된 접착 단지 자기 분리에 의해서도 힘 따라 다양한 생화학 적 방법에 의해 세포 내 신호 전달 경로, 또한 접착 리모델링을 조사 할 수있다. 이 프로토콜은 리간드 공동의 제조를 포함ated 초상 자성 구슬, 그리고 응용 프로그램이 생화학 적 분석 한 다음 인장 힘을 정의합니다. 또한, 우리는 인테그린 기반의 접착에 적용하는 장력을 보여주는 데이터의 대표 샘플이 부착 리모델링을 유발 단백질 티로신 인산화를 변경 제공합니다.
Introduction
후생 동물에서 기계적인 긴장은 증식, 분화 및 생존 1, 2 등 세포 프로세스의 무수의 조절을 통해 조직 개발 및 항상성을 지시합니다. 기계 긴장은 세포 외 기질에서 발생할 수 또는 부착 세포 샘플 세포 외 기질에 끌어과 긴장에 민감한 분자를 통해 강성을 프로브 액토 마이 오신의 수축성 기계를 통해 자신의 세포 외 환경을 생성 할 수 있습니다. 장력에 응답하여, mechanosensitive 접착 단백질은 복잡한 신호 캐스케이드를 트리거 형태 적 변화를 겪는다. 차례로,이 신호 전달 경로는 세포 외 환경에 세포의 행동을 조정 증식, 분화 및 생존을 포괄 mechanoresponse을 조율. 이러한 프로세스는 빠르게 메카의 루프에 다시 공급하는 (초 분) 단기 기간에 정착 될 수있다 mechanosensitive 구조를 수정하여 notransduction. 예를 들어, 인테그린 기반 유착의 Rho는 GTPase 매개 골격 리모델링 3, 4, 5 내지 장력에 응답하여 강화한다. 병행하여, 다른 신호 전달 경로는 결국 세포의 운명 (6) 영향을 미치는 유전 적 프로그램을 제어하는 시간 일 동안 활성화됩니다. 많은 연구가 세포 결정론 질병 발전 1, 2에 매트릭스 강성의 영향을 강조하는 반면, 접착 매개 mechanotransduction의 정확한 분자 메커니즘은 아직 어려운 남아있다.
다양한 방법은 유동 시스템, 형광 공명 에너지 전달 (FRET) -tension 센서 (7)를 포함하여 세포 행동에 셀 생성 힘이나 외력의 영향을 연구하기 위해 개발되어왔다아가씨 = "외부 참조"> 8 호환 기판 (9) 자기 핀셋, 광 핀셋 (10)과 원 자간 력 현미경 (AFM) 11. 여기에서 우리는 특정 접착 수용체에 적용되는 인장 힘에 반응 mechanotransduction 경로의 특성을 초상 자성 비드를 사용하여 프로토콜을 제시한다. 상자성 비드 자기장에 배치 될 때 가역적으로 자화 입자이다. 일단 특정 수용체에 대한 리간드로 코팅이 비드 외 힘 부여의 효과를 연구하기위한 강력한 도구를 제공한다. 이 방법은 여러 연구 3, 5, 12에 의해 검증 된 – (17)과 주로 부착 세포의 생화학 적 분석을 용이하게하는 이점을 제시한다. 생화학 분석 하였다 유사한 콜라겐 – 코팅 된 자성 비드를 이용하여, 초기 작업은 증가를보고긴장 5, 18, 19에 응답 단백질 티로신 인산화에서 RhoA 정품 인증. 후술하는 방법은 3 인테그린인가 장력으로부터 하류 신호 전달 경로의 특성을 피브로넥틴 (FN) 코팅 된 비드와 함께 사용되어왔다. 이 연구에서, Guilluy 등. 장력이 인테그린 접착 단지에 두 개의 구아닌 염기 교환 요인 (GEFs), larg의 및 GEF-H1의 모집을 통해에서 RhoA를 활성화 것으로 나타났다. 그 때문에, 다른 연구는 GEF-H1은 여기에 설명 된 방법론의 견고성을 보여주는, 다른 방법 (20), (21)를 사용하여 세포 생성 긴장에 대한 응답으로 접착 단지에 채용되는 것으로 나타났습니다. 결과적으로, 활성화는 세포 골격에서 RhoA 리모델링을 통해 접착력 강화를 촉진하기 위해 도시 하였다. 이 시스템은 또한 긴장 적용 t을 탐구하는 데 사용 된세포 / 세포 부착 수용체 O. 인테그린 관련 접착 단지 (12)과 유사하게 vinculin 모집의 증가를 유도 E-cadherin의의 세포 외 도메인으로 코팅 된 자성 비드 상 힘의 응용 프로그램입니다. 콜린스와 그의 동료들은 PECAM-1 인테그린 촉진에서 RhoA 활성화 13 긴장의 응용 프로그램을 관찰했다. 자석 구슬을 사용하여 또 다른 실험 방법은 격리 된 핵에 적용 긴장의 연구이다. nesprin-1 핵 엔벨로프 단백질에 대한 항체로 코팅 된 비드를 사용하여, 핵막 착물들은 동적 기계적 장력 (22)에 응답하여 조절되는 것을 보여 정제 하였다. 이러한 결과는 mechanotransduction 경로의 연구에서이 방법의 강력 함을 지원합니다. 흐름 또는 견인력 시스템은 일반적으로 세포 과정을 촉진하면서 또한, 자성 비드는 특히 수용체 리간드를 사용하여 세포 부착 수용체 타겟팅 <suP 클래스 = "외부 참조"> 3 세포 표면 수용체 (13), (15)에 대한 모노클로 날 항체.
이 방법의 또 다른 장점은 간단한 리간드 친 화성 정제 절차를 접착 복합체의 분리이다. 잘 세포에 대한 리간드 – 코팅 구슬의 추가가 부착 수용체를 결합하여 여러 가지 접착 단백질 (23)의 채용을 유도하는 것으로 알려져있다. 리간드 – 코팅 자석 구슬에 힘 또한 응용 프로그램 (24)는, 다양한 장력에 의존하는 신호 전달 경로 (4)을 매개 거대 플랫폼으로 이러한 접착 단지를 켭니다. 자석을 이용하여 비드 농축하여 세포 용해는 접착 플랫폼의 격리를 허용한다. 접착 복합체를 정제하는 데 사용하는 다른 방법이 이미 부착 세포에 사용되어왔다. 이들은 단백질 – 단백질 상호 작용을 보존하는 화학 가교 결합세제 및 전단 흐름 또는 초음파 20, 21, 25, 26, 27, 28에 의해 세포 용해 단계. 마지막 단계는 접착 성 복합체를 함유하는 생성 된 복부 원형질막의 집합이다. 이들 방법과는 달리, 자성 비드를 선택적으로 접착 수용체의 특정 패밀리를 표적으로하여 세포 부착 복합체 더 정제 레벨을 허용한다. 자성 비드가 이미 리간드 피복 된 마이크로 비드 (29), (30)에 부착 된 비 – 부착 세포 접착 복합체를 정제하는 데 사용되어왔다. 힘이 짧은 지속 시간 (분 초)에 적용되는 모방 생물 상황을 설명하는 방법. 따라서, 정제 접착 착체의 분자 구성 모두를 조사하기위한 강력한 도구를 제공하며하류 mechanosensitive-신호 전달 경로.
여기에서 우리는 접착 표면 단백질에 인장 힘을 적용하는 자석 구슬 사용에 대한 자세한 실험 프로토콜을 제시한다. 영구 네오디뮴 자석은 배양 접시 표면의 상단에 배치됩니다. 단일 2.8 ㎛의 자성 비드의 힘 상수 (30-40 PN) (31)가되도록, 자석의 자극면을 6 mm의 높이로 배치된다. 인장 자극 시간은 관심과 활성화의 시간 스케일의 분자에 따라 작업자에 의해 결정된다. 세포는 마지막으로 접착 단지는 자석을 사용하여 비즈 분리로 정제하고, 생화학 적 분석 처리, 용해된다. 이 프로토콜은 리간드 – 코팅 된 상자성 비드의 제조 방법 및 생화학 적 분석 하였다 자석 관통 장력의 적용을 포함한다. 또한, 우리는 인테그린 기반 ADH에 적용하는 장력을 보여주는 데이터의 대표 샘플을 제공esions 접착 리모델링을 유도 단백질의 티로신 인산화를 바꾼다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 기재된 방법은 세포 표면 접착 수용체에 장력을 적용하고 그 이후의 정제를 허용하는 간단한 방법을 구성한다. 그러나 일부 단계는 대상 접착 수용체에 따라 효율적으로 접착 정화 및 잠재적 인 최적화를 수행 할 수 있습니다 수행하는 것이 중요하다. 우리는 사용자가 아래에 발생할 수있는 잠재적 인 문제를 제시한다.
우리는 2.8 μm의 직경 자성 비드를 사용하지만, ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CG는 유럽 연합 (EU) 일곱 번째 프레임 워크 프로그램의 직원은 국립 드 라 공들인 (ANR-13 JSV1-0008), (마리 퀴리 경력 통합 n˚8304162)에서 유럽 연합 (EU)의 지평선에서 유럽 연구위원회 (ERC)에서 보조금 지원 2020 연구와 혁신 프로그램 (ERC 시작 부여 n˚639300).
Materials
| Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
| Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
| Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
| DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
| 60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |
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