клеточной поверхности спайки являются центральными в механотрансдукции, так как они передают механические напряжения и инициировать сигнальных путей, вовлеченных в гомеостаз ткани и развития. Здесь мы приводим протокол для рассечения биохимических путей, которые активируются в ответ на напряжение, используя лиганд покрытием магнитные микрогранулы и применение силы к адгезионных рецепторов.
Механочувствительных адгезии комплексы клеточной поверхности позволяют клеткам ощущать механические свойства их окружения. Недавние исследования выявили как силы зондирования молекул на адгезионных участков, а сила-зависимых факторов транскрипции, которые регулируют экспрессию генов LINEAGE-специфических и драйвом фенотипические выходы. Однако сигнальные сети преобразующие механическую напряженность в биохимических путей, которые остаются неясными. Для изучения сигнальных путей, участвующих на механического напряжения, приложенного к рецептором клеточной поверхности, могут быть использованы суперпарамагнитныо микрогранулы. Здесь мы приводим протокол для использования магнитных шариков для применения силы на клеточной поверхности адгезии белков. Используя этот подход, можно исследовать не только силы-зависимых цитоплазматический сигнальных путей от различных биохимических подходов, но и адгезии ремоделирования магнитной изоляции адгезионных комплексов, присоединенных к лиганд-покрытием бусин. Этот протокол включает в себя подготовку лиганд-сотрудничестваованные суперпарамагнитныо бусы и применение определить силы растяжения с последующим биохимических анализов. Кроме того, мы предоставляем репрезентативную выборку данных, показывающих, что напряжение применяется к адгезии интегрина на основе триггеров адгезии ремоделирования и изменяет белковый фосфорилирования тирозина.
В многоклеточных, механическое напряжение направляет развитие тканей и гомеостаз посредством регуляции множества клеточных процессов , таких как пролиферации, дифференцировки и выживания 1, 2. Механическое напряжение может возникать из внеклеточного матрикса или могут быть получены с помощью адгезивных клеток, которые образец их внеклеточную среду через актомиозиновом сократительной механизма, который вытягивает на внеклеточный матрикс и зонды его жесткость при натяжении чувствительных молекул. В ответ на напряжение, механочувствительных белки адгезии претерпевают конформационные изменения, которые вызывают сложные сигнальные каскады. В свою очередь, эти сигнальные пути оркестровать mechanoresponse охватывающую пролиферацию, дифференцировку и выживание, который регулирует клеточное поведение во внеклеточную среду. Такие процессы могут быть урегулированы в краткосрочном периоде времени (секунды до нескольких минут), чтобы быстро накормить обратно на петлю механиз notransduction путем модификации механочувствительных структур. Например, интегрин на основе спайки усиления в ответ на натяжение через Rho ГТФ-опосредованной цитоскелета ремоделирования 3, 4, 5. Параллельно с этим , другие сигнальные пути активируются в течение часов и дней , чтобы контролировать генетические программы , которые в конечном итоге повлиять на судьбу клеток 6. Принимая во внимание, многие исследования выявили влияние матрицы жесткости на клеточное детерминизма и развития болезни 1, 2, точные молекулярные механизмы адгезии опосредованной механотрансдукции до сих пор остаются неуловимыми.
Различные подходы были разработаны с целью изучения влияния клеточных генерируемых сил или внешних сил на поведение клеток, в том числе систем потока, флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) -tension датчиков 7,деваха = "Xref"> 8, совместимые подложки 9, пинцет, оптический пинцет 10 и атомно – силовой микроскопии (AFM) 11. Здесь мы приводим протокол, используя суперферромагнитных шарики для характеристики механотрансдукция путей в ответ на растягивающих сил, приложенных со специфическими рецепторами адгезии. Суперпарамагнитных шарики представляют собой частицы, которые обратимо обусловливающие намагничивание при помещении в магнитном поле. После того, как покрытые лигандом для конкретного рецептора, эти шарики обеспечивают мощный инструмент для изучения влияния внеклеточной приложения силы. Этот метод был подтверждено несколькими исследованиями 3, 5, 12 – 17 и представить преимущество в значительной степени облегчить биохимический анализ на прилипшие клетки. Используя аналогичные коллаген покрытием магнитных шариков с последующим биохимического анализа, ранние работы сообщили об увеличениипротеин – тирозин – фосфорилирование и активацию RhoA в ответ на натяжение 5, 18, 19. Описанный ниже метод был также использован с фибронектином (FN) -покрытие бусинок , чтобы охарактеризовать сигнальные пути вниз по течению от напряжения , приложенного к интегринов 3. В этом исследовании, Guilluy и др. показали, что напряженность активирует RhoA путем набора двух гуанин нуклеотид обменных факторов (GEFs), Ларг и ГЭФ-H1, с интегрином адгезионных комплексов. Так что, другие исследования показали , что ГЭФ-H1 рекрутируется на адгезионных комплексов в ответ на клеточной сгенерированных напряженности с использованием различных методов 20, 21, демонстрируя устойчивость методологии , описанной здесь. В результате, активированный RhoA было установлено, способствует усиление адгезии, через цитоскелета ремоделирования. Эта система была также использована для изучения натяжения применяется то клеточной адгезии / рецепторами клеток. Применение сил на магнитных шариков , покрытых внеклеточным доменом Е-кадгерина вызвало увеличение набора винкулина аналогично интегринассоциированный адгезионных комплексов 12. Коллинз и его коллеги наблюдали , что применение напряженности PECAM-1 способствует интегрин и активации RhoA 13. Другой экспериментальный подход с использованием магнитных шариков является изучение натяжения применительно к изолированных ядер. Используя шарики , покрытые антителами , направленными против белка ядерной оболочки nesprin-1, оболочечные комплексы ядерных очищались , чтобы показать , что они динамически регулируется в ответ на механическое натяжение 22. Эти результаты подтверждают всемогущество этого метода в изучении механотрансдукции путей. Кроме того, в то время как поток или тяговое усилие системы стимулируют общие клеточные процессы, магнитные шарики, специально нацелены на рецептор клеточной адгезии с использованием либо лиганды рецептора <suр класс = "Xref"> 3 или моноклональные антитела против рецептора клеточной поверхности 13, 15.
Еще одним преимуществом этого метода является выделение адгезионных комплексов посредством простой процедуры очистки лиганда сродства. Хорошо известно , что добавление лиганда покрытием бус клеток связывается с рецепторами адгезии и вызывает набор нескольких адгезивных белков 23. Дальнейшее применение сил лиганд-покрытием магнитных шариков превращает эти адгезионные комплексы в макромолекулярных платформ, опосредует различные натяжные-зависимые сигнальные пути , 4, 24. Лизис клеток с последующей концентрацией шарик с помощью магнита позволяет выделить адгезионных платформ. Другие методы, используемые для очистки адгезии комплексы уже использовались в прикрепленных клетках. Они сочетают в себе химическое сшивание, чтобы сохранить белок-белковых взаимодействийи стадию лизиса клеток с помощью моющего средства и сдвига потока или обработки ультразвуком 20, 21, 25, 26, 27, 28. Последним шагом является сбор полученных брюшных плазменных мембран, содержащих адгезионных комплексов. В отличие от этих методов, магнитные шарики позволяют большую степень очистки клеточной адгезии комплексов путем селективного ориентации конкретного семейства рецепторов адгезии. Магнитные шарики уже используют для очистки адгезионные комплексов в неприлипающими клеток , прикрепленных к микрошариков лиганд-покрытием 29, 30. Метод, описанный ниже, имитирует биологических ситуациях, когда сила приложена в течение короткого периода (продолжительного секунд до минут). Таким образом, он представляет собой мощный инструмент для исследования как молекулярный состав очищенных адгезионных комплексов ивниз по течению механочувствительных-сигнальных путей.
Здесь мы представляем подробный экспериментальный протокол для использования магнитных шариков, чтобы применить растягивающие силы на поверхности адгезии белков. Постоянный неодимовый магнит помещается на верхней части поверхности культуры блюдо. Поверхность полюса магнита помещают на высоте 6 мм , так что усилие на одной магнитной бусинки 2,8 мкм постоянна (около 30-40 Pn) 31. Длительность стимуляции натяжения определяется оператором в зависимости от интересующей молекулы и ее масштаб времени активации. Клетки в конце концов лизируют, адгезивные комплексы очищают с помощью разделения бусин с помощью магнита и биохимические анализы обрабатываются. Этот протокол включает в себя получение лиганда покрытием суперпарамагнит- шариков, а также применение напряженности с помощью магнита с последующим биохимических анализов. Кроме того, мы предоставляем репрезентативную выборку данных, показывающих, что напряжение применяется к интегрину на основе АДГesions индуцирует адгезию ремоделирования и изменяет белковый фосфорилирования тирозина.
Описанный здесь метод представляет собой простой подход, чтобы применить напряжение к клеточной поверхности рецепторов адгезии и позволяют их последующую очистку. Тем не менее, некоторые шаги имеют решающее значение для выполнения эффективной очистки адгезии и потенциал оптимизаци?…
The authors have nothing to disclose.
CG поддерживается за счет грантов от Национального агентства-де-ла-Recherche (ANR-13-JSV1-0008), из седьмой рамочной программы Европейского союза (Мари Кюри Карьера интеграции n˚8304162) и от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках Horizon Европейского Союза 2020 исследований и инноваций программы (ERC Запуск Грант n˚639300).
Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | DX88-N52 | grade N52 dimension: 1 1/2" dia. x 1/2" thick |
Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish) | K&J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | grade N42 dimension: 1/2" dia. x 1/4" thick Black Plastic Coated |
Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetic beads |
DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronectin from bovine plasma |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Bovine Apo-Transferrin |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
60*15 mm culture dish | Falcon | 353004 |