Præsenteret her er en simpel teknik til konfocal time-lapse billedbehandling af rot og hypokotyl i høj opløsning i op til 3 dage ved brug af høje numeriske blændemål og perfluorodecalin som et nedsænkningsmedium.
Flere aspekter af planteudvikling, såsom lateral rotmorfogenese, forekommer på tidsintervaller på flere dage. For at undersøge underliggende cellulære og subcellulære processer kræves højopløsnings-tidsforskydningsmikroskopi strategier, der bevarer fysiologiske tilstande. Plantevæv skal have tilstrækkelig næringsstof og vandforsyning med vedvarende gasudveksling, men når de nedsænkes og immobiliseres under et dækslip, er de særligt modtagelige for anoxi. En strategi, der har været anvendt med succes, er brugen af et perfusionssystem for at opretholde en konstant tilførsel af ilt og næringsstoffer. Sådanne arrangementer kan imidlertid være komplicerede, besværlige og kræve specialudstyr. Præsenteret her er en alternativ strategi for et simpelt billeddannelsessystem ved anvendelse af perfluorodecalin som et nedsænkningsmedium. Dette system er let at installere, kræver minimal udstyr og er let monteret på et mikroskopstrin, hvilket gør det muligt at oprette og afbilde flere billedkamre i parallel. I dette system er laterale rotvæksthastigheder skelnes fra vækstrater under standardbetingelser på agarplader i de første to dage, og lateral rotvækst fortsætter med reducerede hastigheder i mindst en anden dag. Plantevæv leveres med næringsstoffer via en agarplade, som også kan anvendes til administration af en række farmakologiske forbindelser. Systemet blev oprettet for at overvåge lateral rodudvikling, men er let at tilpasse til andre planteorganer som f.eks. Hypokotyler og primære rødder.
For at studere cellulære og subcellulære processer, der ligger til grund for planteudvikling, er der en stigende efterspørgsel efter langvarige time-lapse-billeddannelsesstrategier. En vigtig udfordring i sådanne billeddannelsesforsøg er vedligeholdelsen af fysiologiske forhold, herunder tilstrækkelig gasudveksling samt en forsyning af vand og næringsstoffer 1 , 2 , 3 . For at udnytte mål med høje numeriske åbninger for optimal optisk opløsning, skal prøver placeres i nærheden og orienteret parallelt med dækslet. Bevægelse i x, y og z retninger bør ideelt set være minimal under billeddannelsen.
Mens kimplanter ofte er monteret i vand eller vandig opløsning til kortvarig billeddannelse, har vand en lav kapacitet til opløsning af CO 2 og O 2 (1,54 mg / ml og 0,04 mg / ml henholdsvis ved 20 ° C, 0,1 MPa) 4 , Hvilket gørDen er uegnet til forlængede tidsforskydningsforsøg. Perfusionssystemer, der opretholder konstante niveauer af ilt og næringsstoffer, er en løsning på dette problem og er blevet udviklet til både confocal laser scanning microscopy (CLSM) 1 , 2 , 3 og lysmikroskopi (LSM) 5 . Systemer som RootChip 2 og RootArray 3 er designet specielt til tidsforskydning af billeddannelse af udviklende rødder og involverer spiring af frø i en specialbygget flerprøveanordning. Disse arrangementer sikrer minimal mekanisk forstyrrelse og er designet til parallelanalyse af flere kimplanter, men er ikke optimeret til billeddannelse af subcellulære strukturer. Calder og kolleger har designet et mere kompliceret perfusionsbaseret billedkammer optimeret til billeddannelse af subcellulære strukturer, hvor prøven holdes i position ved hjælp af en maskeAt tillade brug af høj forstørrelsesdyser linser 1 .
Præsenteret her er en alternativ, enkel løsning på dette problem, som ikke er baseret på perfusionssystemer, men anvender perfluorodecalin (PFD), et perfluorcarbon, der for nylig er blevet populært som et monteringsmedium til arabidopsis-billeddannelse 6 , 7 , 8 . I sådanne applikationer tillader den høje kapacitet af PFD til opløsning af CO 2 og O 2 (1,9 g / ml for O 2 i PFD sammenlignet med 0,04 mg / ml i vand) 9 , gasudveksling ved det nedsænkede væv. Endvidere er PFD ikke-fluorescerende, og dets brydningsindeks (1.313) kan sammenlignes med vandet (1.333) og er tættere på cytosol (~ 1,4) end luft (1.000) 6 . Perfluorcarboner er blevet rapporteret at have minimal fysiologisk effekt på en række planter og planterProblemer 6 , med radisefrø, der let frigør, når de nedsænkes i PFD og udviser normal vækst og udvikling i mindst to fulde dage, når de leveres med vand 10 . Lignende observationer er blevet gjort for at spire arabidopsisfrø 6 . Baseret på stimuleret Raman-spredning for at direkte billedet distributionen af PFD i Arabidopsis bladvæv efter infiltration konkluderer Littlejohn og kolleger, at PFD sandsynligvis ikke optages af levende celler 8 . PFD er tidligere blevet anvendt overvejende til billedvæv, hvor det signifikant øger billeddybden, da det let infiltrerer luftrum på grund af dets lave overfladespænding 6 . Her vedtages PFD til langsigtet konfokal billeddannelse af udvikling af laterale rødder. I denne konfiguration anbringes en eller flere plantager på en plade af vækstmedium størknet med agar og nedsænket i PFD. PFD'en tillader gAseous udveksling i billedkammeret, forebyggelse af anoxi. PFD er meget flygtig, så det fastholdes af en pakning af poly (dimethylsiloxan) gummi, som også har høj gaspermeabilitet (1,5 x 10-12 pmol m -1 s -1 Pa -1 for CO 2 ) 11 . Næringsstoffer og vand leveres af pladen af medium størknet med agar. Samtidig trykker denne agarplade forsigtigt mod roten mod dækslet, og fastgør dermed sin relative position i billedkammeret og tillader brugen af vandopløsninger med høj opløsning. Agarpladen kan endvidere anvendes til at administrere en række farmakologiske behandlinger, herunder dexamethason, oryzalin og isoxaben. Billedkamrene kan monteres i stort antal fra standardmikroskopi dias ved hjælp af minimalt udstyr. Billedkamrene blev udviklet og karakteriseret til at studere lateral rodudvikling, men er tilpasselige til billeddannelse af andre kimplanter, såsom primære rodtip ogkimstænglerne.
Metoden, der præsenteres her, er en simpel strategi for højopløselig konfokal billeddannelse af udvikling af laterale rødder i to og op til tre dage. I perioder på op til 48 timer blev der ikke observeret nogen negative virkninger af billeddannelsessystemet på lateral rodudvikling. Efter 48 timer begyndte den gennemsnitlige laterale rodvækst at bremse, selv om en betydelig delmængde af rødderne (37%) fortsatte med at vokse med satser, som kunne sammenlignes med den gennemsnitlige rotvækst på plader. Derfor kan der ved billeddannelse et tilstrækkeligt stort antal rødder udelukkes rødder, hvis vækst falder efter 48 timer. Systematiske afprøvninger af billedkamrene blev ikke udført i perioder længere end 72 timer, men alternative strategier anbefales, hvis udvidede billeddannelsesperioder ønskes. Imagingkamre kan efterlades kontinuerligt på mikroskopfasen, hvis passende miljømæssige forhold er tilvejebragt eller fjernet til en vækstfacilitet og periodisk returneret til mikroskopet. Dette gør det muligt for mange kamre at blive afbildet parallelt. </ P>
En fordel ved de her beskrevne kamre er, at laterale rødder er fikseret i deres position og kan afbildes ved brug af vandopløsninger med høj opløsning. Den rumlige stabilitet afhænger kritisk af den agarkoncentration, der anvendes i den bærende agarplade. I første omgang blev en række forskellige koncentrationer fra 0,8% agar til 2% agar testet, hvilket viste, at høje koncentrationer i dette område stabilt fikserede rødder i rummet, men rodvæksten blev hurtigere og nogle rødder udviste tegn på mekanisk stress, herunder nedsat celleforlængelse. I modsætning hertil tilvejebragte lave agarkoncentrationer ikke den nødvendige understøttelse, og rødderne drev i x, y og z under billeddannelsen. Den optimale 1,5% agarplade løser prøvenes position uden negative mekaniske virkninger. Under disse forhold er roderne stabile i løbet af mange timer efter afregning i løbet af de første 30 minutter, hvilket muliggør overtagelse af data natten over. Under erhvervelse af 4D-data var z-stack-rækker typisk bRacketed med en yderligere 5-10 μm, men dette var hovedsagelig at rumme ud-af-plan vækst af laterale rødder i stedet for z-drift eller wobble. Selvom standardagarkoncentrationen giver en vis modstand mod penetration, vil gravitropisk voksende rødder til sidst trænge igennem agaret. Men gennem en mindre ændring af billedkammeret kunne rodvækst opretholdes parallelt med dækslet, hvilket gør det muligt at billedere ældre laterale rødder og primære rødder. Endvidere kunne det grundlæggende billedkammer nemt tilpasses til hypokotyler. Hypokotyler er mere fritflydende i dette system, så z-aksenbeslaget til billedoptagelse blev normalt forøget til ca. 20 μm. I denne undersøgelse blev der anvendt et opretstående mikroskop i hele, hvilket tillod at substrategenskaberne blev styret. Billedkammeret kan være tilpasseligt til inverterede mikroskopkonfigurationer, men den tidsafhængige indflydelse af den stive dæklip på aflytningsorganer skal evalueres. </p>
Littlejohn og kolleger har påpeget, at PFD selv ikke let opløses biologiske molekyler, hvilket betyder, at det ikke kan anvendes direkte til levering af farmakologiske forbindelser 7 . Dette problem blev overvundet ved at forsyne sådanne forbindelser gennem pladen af størknet vækstmedium, hvorpå agarpladen hviler. Mens perfusionssystemer vil forblive den valgte metode til udvaskningsforsøg, er billedkammeret blevet anvendt med succes til administrationen af dexamethason 12 og andre forbindelser. En note, mens denne artikel var under forberedelse, beskrev Wagenheim og kolleger 18 et kammer til billeddannelse af lateral rodudvikling ved hjælp af lysarkmikroskopi.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Prof. Geoffrey Wasteneys, University of British Columbia, for frøudtryk RFP-TUB6 og en anonym anmelder for nyttige korrektioner. Vi er taknemmelige for Prof. Hugh Dickinson for at advare os om brugen af cellulosefilm som en mekanisk støtte og til John Baker til fotografering. Dette arbejde blev understøttet af BBSRC forskningsstipendier BB / G013993 / 1 og BB / D004055 / 1 til IM, og en BBSRC Doktorsuddannelse og Clarendon Scholarship til CK
Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13mm diameter and 0.2-0.4mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80mm disc |