Die Erzeugung von Fluorescent Protein Fusions in<em> Candida</em> Arten

Summary

PCR-vermittelte Gen – Modifikation kann verwendet werden , fluoreszierendes Protein – Fusionen in Candida – Spezies zu erzeugen, die Visualisierung und Quantifizierung von Hefezellen und Proteinen erleichtert. Hier präsentieren wir eine Strategie für ein fluoreszierendes Protein – Fusion (ENO1-FP) in Candida parapsilosis zu konstruieren.

Abstract

Candida – Spezies, weit verbreitete Kolonisatoren der Darm- und Urogenitaltrakts, sind die Ursache für die Mehrzahl der invasiven Pilzinfektionen beim Menschen. So werden molekulare und genetische Werkzeuge benötigt, um die Untersuchung ihrer Pathogenese-Mechanismen zu erleichtern. PCR-vermittelte Genveränderung ist eine einfache und schnelle Ansatz Epitop-markierte Proteine ​​zu erzeugen, deren Nachweis zu erleichtern. Insbesondere sind fluoreszierendes Protein (FP) Fusionen leistungsfähige Werkzeuge, die Visualisierung und Quantifizierung von beiden Hefezellen und Proteine, die durch Fluoreszenzmikroskopie und Immunoblotting ermöglichen, respectively. Plasmide enthalten FP – codierenden Sequenzen, zusammen mit Nahrungsmarkergene, die die Transformation von Candida – Arten zu erleichtern, wurden zum Zwecke der FP Konstruktion und Expression in Candida erzeugt wird . Hier präsentieren wir eine Strategie für eine FP – Fusion in einer Candida – Spezies zu konstruieren. Plasmide, die die Nourseothricin resista enthältnce Transformationsmarker – Gen (NAT1) zusammen mit Sequenzen für entweder grün, gelb oder Kirsche FPs (GFP, YFP, mCherry) zusammen mit Primer verwendet , die Gen-spezifische Sequenzen in einer Polymerase – Kettenreaktion (PCR) eine FP – Kassette zu erzeugen , . Diese genspezifischen Kassette hat die Fähigkeit, in das 3'-Ende des entsprechenden Genlocus durch homologe Rekombination zu integrieren. Erfolgreich in-frame-Fusion der FP-Sequenz in das Gen-Locus von Interesse genetisch überprüft, gefolgt von einer Analyse der Fusionsprotein-Expression mittels Mikroskopie und / oder Immundetektionsverfahren. Darüber hinaus ist für den Fall von stark exprimierten Proteine ​​können erfolgreiche Fusionen für primär durch Fluoreszenz-Bildgebungstechniken gescreent werden.

Introduction

Candida – Spezies sind symbiotischer Pilze , die die Darm- und Urogenitaltrakts aller Menschen besiedeln. Unter den Bedingungen der Immunschwäche, wie das mit Frühgeburt auftreten oder immunsuppressive Wirkung von Behandlungen für Krebs, kann Candida – Spezies opportunistischen Erregern werden. Von den Candida – Spezies, ist Candida albicans die häufigste Pilz Kolonisator und bewirkt , dass die Mehrheit der invasiven Pilzinfektionen. Andere Candida – Spezies wie C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis und C. kruseii auch schwere Infektionen bei immunsupprimierten Patienten verursachen, mit einigen ausstellenden intrinsische Resistenz gegen häufig Anti-Pilz – Antibiotika wie Fluconazol und Amphotericin B. Daher verwendet, Infektionen mit einigen dieser Arten werden immer häufiger, insbesondere bei Patienten beobachtet prophylaktisch mit Anti-Pilz-Mittel behandelt werden. Auch bei angemessene und rechtzeitige einNTI-Pilz – Behandlung, invasive Candida – Infektionen weiterhin mit einer signifikanten Morbidität und Mortalität ¹ verbunden zu werden. Wegen der Bedeutung von Candida – Spezies in die menschliche Gesundheit besteht ein Bedarf an leicht verfügbaren molekularen Werkzeugen, die die Studie und Aufklärung ihrer Pathogenese – Mechanismen ermöglichen.

Ein wichtiges Instrument, das Forscher ermöglicht die Visualisierung und mikrobiellen Zellen und die Proteine ​​zu quantifizieren, die sie zum Ausdruck bringen ist FP-Fusion-Technologie. Polymerase – Kettenreaktion (PCR) -vermittelte Modifikation Gen, wie in diesem Dokument beschrieben ist , ermöglicht die Konstruktion von Fusionen zwischen FP – Sequenzen und ein Candida Protein von Interesse an seiner genomischen Locus codierende Sequenz. Stabile Integration des Konstrukts erleichtert Analyse der Proteinexpression sowie Proteinlokalisierung Dynamik. Plasmide enthalten FP – Sequenzen, die für die Expression in Candida albicans optimiert und das kann in der PCR-vermittelten g verwendet werdenene Modifikationsstrategie wurden zuvor konstruiert ^{2, 3, 4, 5.} Plasmide enthalten FP transformation "Kassetten": eine Sequenz FP auf einen Ernährungsmarker – Gen verknüpft, die die Transformation von C. albicans und C. parapsilosis ^{2, 3, 4, 5, 6, 7} erleichtert. Derzeit verfügbare Plasmide enthalten eine Vielzahl von selektierbaren Markergenen Nahrungs (URA3, HIS1, ARG4) für die Transformation von auxotrophen Stämmen sowie eine dominant Arzneimittelresistenzmarker (NAT1), die Auxotrophien fehlt Transformation von klinischen Stämmen ermöglicht. Darüber hinaus enthalten die Plasmide Optionen für bis zu vier verschiedenen FP-Sequenzen (grün [GFP], yellow [YFP], cyan [CFP] und Kirsche [mCherry]) und entweder eine ADH1 Terminierungssequenz für den Bau von Carboxy-terminus Protein – Fusionen oder einer Promotorsequenz für den Bau von Amino-Terminus Protein – Fusionen. Primer werden mit Homologie zu der Plasmid-DNA rund um die FP-Kassette entwickelt. Außerdem enthalten die Primer auch 5'-Verlängerungssequenzen eine Homologie zu dem Hefe – Gen von Interesse trägt markiert werden, der Integration der Kassette in den genomischen Locus durch homologe Rekombination (Figur 1) erleichtert. Genspezifischen FP Kassetten werden durch PCR erzeugt und dann umgewandelt in Candida – Zellen kompetent gemacht für die Aufnahme von DNA durch Behandlung mit Lithiumacetat.

Abbildung 1: Diagramm der wie FP – Sequenz – Fusionen in Candida – Spezies erzeugt werden. (A) Plasmid DNA includes eine FP – Sequenz und eine Sequenz , die Nourseothricin Widerstand (NAT1). Relativen Positionen Vorwärts (FWD) und rückwärts (REV) Primer gezeigt sind, mit schwarzen Abschnitte der Primer die Region der Homologie zu dem Plasmid-Sequenz anzeigt, und die purpurrote Bereiche bezeichnet die genspezifischen Region Homologie oder Primerverlängerung. (B) FP – Kassetten werden in Candida umgewandelt und zu integrieren in der ENO1 genomischen Locus durch homologe Rekombination (gestrichelte Linien). (C) Resultierende FP Fusionssequenz am 3' – Ende von ENO1. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Hier stellen wir ein Beispiel für Protein – Fusion (ENO1-FP) Konstruktionen in Candida – Spezies. Wir verwenden Tagging Plasmide , die die NAT1 Transformation Markergen zusammen mit Sequenzen , die für GFP, YFP enthält, odermCherry (Abbildung 2). Diese Plasmide werden zusammen mit den Primern in PCR verwendet , um genspezifische Kassetten erzeugen , die Fusion von FPs an das 3'-Ende ENO1 erleichtern, was zu einer Expression von ENO1 fusioniert an FPs an seinem Carboxy-Terminus.

Abbildung 2: Karten von FP – Kassette enthaltenden Plasmide. Vorwärts (F) und rückwärts (R) Primer verwendet, um die Kassetten aus den Plasmiden zu erzeugen, zusammen mit der relativen Lage ihrer Homologie zu den Plasmiden angegeben. Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt. F1 und R1 wurden auch zur Erzeugung der pYFP- NAT1 Kassette verwendet. Das Plasmid , das das YFP- NAT1 Kassette (pMG2263) enthält , ist identisch mit pMG2120 mit Ausnahme von YFP anstelle des GFP – Sequenz. Kassettengrößen: GFP-NAT1, 3,7 kbp; mCherry- NAT1, 3,2 kbp; YFP- NAT1, 3.7 kbp. Diese Zahl wurde von Gerami-Nejad modifiziert, et al. ⁴ Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protocol

1. Isolieren Sie Template Plasmide aus E. coli Wachsen E. coli das Templat – Plasmid bei über Nacht in 10 ml LB-Medium (LB) + 200 mg / L Ampicillin (AMP) 37 ° C enthält , unter Schütteln. Ernten Sie die Zellen durch bei 6.000 × g für 2 min zentrifugiert. Dekantieren Flüssigkeit, Isolierung und Reinigung von DNA aus E. Zellen durch ein Standardverfahren coli wie zuvor beschrieben in Ausubel et al. 8. Resus…

Representative Results

Als Beispiel haben wir dem oben beschriebenen Protokoll GFP und mCherry Fusionen zu konstruieren , in einem C. parapsilosis Laborstamm zu ENO1. Jeder mutmaßliche Trans wurde ursprünglich für das Wachstum erneut ausgestrichen. In diesem Beispiel wird , da das resultierende Fusionsprotein stark exprimiert (Enolase) und die FPs sind hell, wir in der Lage waren Trans durch Fluoreszenzmikroskopie zur Durchführung von diagnostischen PCR vor dem Bildschirm (Abbildung 3)</st…

Discussion

Konstruktion von Epitop – markierten Sequenzen in Candida Spezies die PCR-vermittelte Gen – Modifikationsstrategie oben beschrieben verwendet , kann als ein dreistufiges Verfahren zusammengefaßt werden. Zunächst wird eine Kassette durch PCR hergestellt, die die Sequenz homolog zur Integration und Regionen gewünschten codiert sowohl auf den Ort des Einfügens in das Hefegenom. Zweitens werden die Hefezellen transformiert werden, mit der Kassette chemisch kompetente mit Lithiumacetat und co-inkubiert hergestel…

Materials

100W mercury lamp	CHIU Technical Corporation	M-100T
95% Ethanol	Any	NA
Adenine	Any	NA
Ampicillin	Any	NA
Carrier DNA	Ambion	AM9680	Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml
CCD Camera	Photometrics	CoolSNAP HQ
Conical Tube	Corning	430828	50ml
Culture Tube Rotator	New Brunswick	2013923	TC-8, or Any Culture Tube Rotator
Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade	Any	NA
Eppendorf Tubes	Eppendorf	022363719, 022363212	0.5ml, 1.5ml
Erlenmeyer Flask	Fisher Scientific	7250089	125ml
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Any	NA
Freezer (-80 °C )	Thermo Electron Corporation	ULT-1386-9-V	Revco Ultima II
GFP, YFP and Texas Red Filter Sets	Chroma Technology Corporation	49002, 86004v2, 49008
Glass culture tubes	Fisher Scientific	1496126	75mm
HRP goat anti-mouse antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-2005
HRP goat anti-rabbit antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-2301
Incubator (30 °C )	Any	NA
Lithium Acetate	Any	NA
Lysogeny Broth (LB) Media	Any	NA
Magnesium Chloride	Any	NA
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
Microscope	Nikon	E600	Nikon Eclipse E600
Microscope Image Analysis Software	Universal Imaging Corporation	6.3r7	MetaMorph Software Series 6.3r7
Mouse anti-GFP antibody	Roche	11814460001
Nourseothricin	Fisher Scientific	50997939
PCR Thermocycler	Applied Biosystems	9700	GeneAmp PCR System
PCR tubes	BioExpress, GeneMate	T-3035-1	0.2ml
Polyethylene Glycol 3350	Any	NA
Potassium Chloride	Any	NA
Rabbit anti-mCherry antibody	BioVision	5993-100
Refrigerator (4°C)	Any	NA
Sodium Acetate	Any	NA
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1500
Table Top Centrifuge	Labnet	Z 400	Hermle Z 400
Taq DNA Polymerase	Any	NA
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Any	NA
Vortex Mixer	Scientific Industries	SI-0236	Vortex Genie 2
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media	Any	NA