Generering av Fluorescent Protein Fusions i<em> Candida</em> Arter

Summary

PCR-mediert gen modifikasjon kan brukes til å generere fluorescerende proteinfusjoner i Candida art, som muliggjør visualisering og kvantifisering av gjærceller og proteiner. Heri presenterer vi en strategi for å konstruere et fluorescerende protein fusjon (Eno1-FP) i Candida parapsilosis.

Abstract

Candida-arter, utbredt kolonisatorer intestinal og urin traktater, er årsaken til de fleste av invasive soppinfeksjoner hos mennesker. Dermed er molekylære og genetiske verktøy for å legge til rette studiet av deres patogeneserelaterte mekanismer. PCR-mediert genmodifisering er en enkel og rask måte å generere epitop-merket proteiner for å lette deres oppdagelse. Spesielt fluorescerende protein (FP)-fusjoner er kraftige verktøy som tillater visualisering og kvantifisering av både gjærceller og proteiner ved fluorescens mikroskopi og immunblotting, respektivt. Plasmider inneholdende FP kodende sekvenser, sammen med nærings-markørgener som letter transformasjon av Candida arter, er blitt generert i den hensikt å FP konstruksjon og ekspresjon i Candida. Heri presenterer vi en strategi for å bygge en FP fusjon i en Candida-arter. Plasmider som inneholder nourseothricin sveisince transformasjon markør-gen (Nat1) sammen med sekvenser for enten grønn, gul, eller kirsebær FPS (GFP, YFP, mCherry) brukes sammen med primere som inneholder gen-spesifikke sekvenser i en polymerase kjedereaksjon (PCR) for å generere en FP kassett . Dette genspesifikke kassett har evnen til å integrere seg i 3'-enden av det tilsvarende gen locus via homolog rekombinasjon. Vellykket i-ramme fusjon av FP sekvens i genet locus av interesse blir verifisert genetisk, etterfulgt av analyse av fusjonsprotein-ekspresjon ved mikroskopi og / eller immuno-deteksjonsmetoder. I tillegg, i tilfellet av høyt uttrykte proteiner, vellykkede fusjoner kan screenes for i første rekke ved fluorescens bildeteknikker.

Introduction

Candida-arter er commensal sopp som kolonisere tarm og urogenitale områder av alle mennesker. Under tilstander med immunsvikt, så som det som forekommer med prematur fødsel eller immunsuppressive effekter av behandlinger for kreft, kan Candida-arter bli opportunistiske patogener. Av de Candida-arter, er Candida albicans den mest utbredte sopp kolonisator og forårsaker de fleste av invasive soppinfeksjoner. Andre Candida-arter som C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis og C. kruseii også forårsake alvorlige infeksjoner hos immunkompromitterte pasienter, med noen oppviser iboende motstand mot brukte anti-fungal antibiotika slik som fluconazol og amfotericin B. Derfor infeksjoner med noen av disse artene blir observert oftere, spesielt hos pasienter som behandles profylaktisk med antisoppmidler. Selv med riktig og rettidig enNTI-soppbehandling, invasive Candida-infeksjoner fortsette å være assosiert med signifikant morbiditet og mortalitet ^1. På grunn av betydningen av Candida-arter i menneskers helse, er det et behov for lett tilgjengelige molekylære verktøy som tillater studiet og klarlegging av deres patogenese mekanismer.

Et viktig verktøy som lar forskere å visualisere og kvantifisere mikrobielle celler og proteiner som de uttrykker er FP fusion teknologi. Polymerase kjedereaksjon (PCR) -mediert gen modifikasjon, slik det er beskrevet i denne artikkelen, tillater bygging av fusjoner mellom FP sekvenser og en Candida-protein-kodende sekvens av interesse ved dens genomiske locus. Stabil integrering av konstruksjonen forenkler analysen av protein ekspresjon, så vel som proteinlokaliserings dynamikk. Plasmider inneholdende sekvenser som FP, optimalisert for ekspresjon i Candida albicans, og som kan brukes i PCR-mediert gene modifikasjon strategi, er tidligere bygget ^{2, 3, 4, 5.} Plasmider som inneholder FP transformasjon "kassetter": et FP-sekvens bundet til et ernæringsmessig markørgen som muliggjør transformasjon av C. albicans og C. parapsilosis ^{2, 3, 4, 5, 6, 7.} For tiden tilgjengelige plasmider inneholder en rekke valgbare markørgener ernærings (URA3, HIS1, ARG4) for omforming av auxotrofe stammer, så vel som en dominant medikamentresistensmarkør (Nat1), som muliggjør transformasjon av kliniske stammer mangler auxotrophies. I tillegg plasmider inneholder muligheter for opptil fire forskjellige FP sekvenser (grønn [GFP], yellow [YFP], cyan [CFP] og kirsebær [mCherry]) og enten en ADH1 termineringssekvens for bygging av carboxyenden proteinfusjoner, eller en promotorsekvens for bygging av amino-terminale proteinfusjoner. Primerne er utformet med homologi med plasmid-DNA som omgir FP kassetten. I tillegg primerne inneholder også 5'-forlengelse sekvenser som bærer homologi til gjærgenet av interesse å bli merket, noe som letter integrering av kassetten i det genomiske lokuset via homolog rekombinasjon (figur 1). Genspesifikke FP-kassetter er generert ved PCR og deretter transformert inn i Candida-celler som er gjort kompetente for opptak av DNA ved behandling med litium-acetat.

Figur 1: Diagram av hvordan FP sekvens fusjoner blir generert i Candida-arter. (A) Plasmid-DNA inklues en FP sekvens og en sekvens som koder nourseothricin motstand (Nat1). Relative steder av Forward (FWD) og revers (REV) primere er vist med svarte deler av primere som indikerer regionen av homologi til plasmidet sekvens og lilla deler betegner genet spesifikke homologi region eller primer extension. (B) FP kassetter er forvandlet til Candida og integrere i ENO1 genomiske locus via homolog rekombinasjon (stiplede linjer). (C) Resulterer FP fusjon sekvens på 3'end av ENO1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Heri presenterer vi et eksempel på proteinfusjon (Eno1-FP) konstruksjoner i Candida-arter. Vi bruker tagging plasmider som inneholder Nat1 transformasjon markørgenet sammen med sekvenser som koder GFP, YFP, ellermCherry (figur 2). Disse plasmidene brukes sammen med primere i PCR for å generere genspesifikke kassetter som lette fusjon av fps til 3'-enden av ENO1, noe som resulterer i ekspresjon av Eno1 kondensert til fps ved sin karboksy-terminus.

Figur 2: Kart over FP kassett som inneholder plasmider. Forover (F) og omvendt (R) primere som brukes for å generere kassettene fra plasmidene er angitt sammen med den relative plasseringen av deres homologi til plasmidene. Primer sekvenser er som angitt i tabell 1. F1 og R1 ble også brukt for å generere pYFP- Nat1 kassetten. Plasmidet inneholdende YFP- Nat1 kassetten (pMG2263) er identisk med pMG2120 med unntak av YFP i stedet for GFP-sekvensen. Kassett størrelser: GFP-Nat1, 3,7 KBP; mCherry- Nat1, 3,2 kbp; YFP- Nat1, tre.7 kbp. Dette tallet har blitt forandret fra Gerami-Nejad, et al. ⁴ Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

1. Koble Mal Plasmider fra E. coli Dyrke E. coli som inneholder plasmidet malen over natten i 10 ml lysogeni buljong (LB) + 200 mg / l ampicillin (AMP) ved 37 ° C med risting. Høste cellene ved sentrifugering ved 6000 xg i 2 min. Dekanter væsken, isolere og rense DNA fra E. coli-celler ved en standard metode som tidligere beskrevet i Ausubel et al. 8. Resuspender DNA i Tris-EDTA (TE; 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH …

Representative Results

Som et eksempel brukte vi den protokoll som er beskrevet ovenfor for å konstruere GFP og mCherry fusjoner til Eno1 i en C. parapsilosis laboratoriestamme. Hver antatte transformant ble opprinnelig gjenutstrøket for vekst. I dette eksempel, siden det resulterende fusjonsprotein er sterkt uttrykt (enolase) og FPS er lyse, var vi i stand til å screene transformanter ved fluorescens mikroskopi før gjennomføring diagnostisk PCR (figur 3) 6.</su…

Discussion

Bygging av epitop tagget sekvenser i Candida-arter ved hjelp av PCR-mediert genmodifisering strategi beskrevet ovenfor kan oppsummeres som en tre-trinns prosess. For det første er en kassett laget ved PCR som koder for både den ønskede for integrering og regioner homologe til det geometriske sted for innføring i gjærgenomsekvens. For det andre, blir gjærcellene som skal transformeres gjøres kjemisk kompetent med litiumacetat og ko-inkubert med kassetten. For det tredje, blir cellene sådd ut på selektiv…

Materials

100W mercury lamp	CHIU Technical Corporation	M-100T
95% Ethanol	Any	NA
Adenine	Any	NA
Ampicillin	Any	NA
Carrier DNA	Ambion	AM9680	Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml
CCD Camera	Photometrics	CoolSNAP HQ
Conical Tube	Corning	430828	50ml
Culture Tube Rotator	New Brunswick	2013923	TC-8, or Any Culture Tube Rotator
Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade	Any	NA
Eppendorf Tubes	Eppendorf	022363719, 022363212	0.5ml, 1.5ml
Erlenmeyer Flask	Fisher Scientific	7250089	125ml
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Any	NA
Freezer (-80 °C )	Thermo Electron Corporation	ULT-1386-9-V	Revco Ultima II
GFP, YFP and Texas Red Filter Sets	Chroma Technology Corporation	49002, 86004v2, 49008
Glass culture tubes	Fisher Scientific	1496126	75mm
HRP goat anti-mouse antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-2005
HRP goat anti-rabbit antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-2301
Incubator (30 °C )	Any	NA
Lithium Acetate	Any	NA
Lysogeny Broth (LB) Media	Any	NA
Magnesium Chloride	Any	NA
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
Microscope	Nikon	E600	Nikon Eclipse E600
Microscope Image Analysis Software	Universal Imaging Corporation	6.3r7	MetaMorph Software Series 6.3r7
Mouse anti-GFP antibody	Roche	11814460001
Nourseothricin	Fisher Scientific	50997939
PCR Thermocycler	Applied Biosystems	9700	GeneAmp PCR System
PCR tubes	BioExpress, GeneMate	T-3035-1	0.2ml
Polyethylene Glycol 3350	Any	NA
Potassium Chloride	Any	NA
Rabbit anti-mCherry antibody	BioVision	5993-100
Refrigerator (4°C)	Any	NA
Sodium Acetate	Any	NA
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1500
Table Top Centrifuge	Labnet	Z 400	Hermle Z 400
Taq DNA Polymerase	Any	NA
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Any	NA
Vortex Mixer	Scientific Industries	SI-0236	Vortex Genie 2
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media	Any	NA