Modelleren van eierstokkanker Meercellige Sferoïde Gedrag in een dynamische 3D peritoneale microdevice
Summary
Ovariële tumorprogressie te bestuderen in een fysiologisch relevante model multicellulaire sferoïden werden gekweekt in een micro-inrichting onder gesimuleerde fluïdumstroming. Deze dynamische 3D-model emuleert de intraperitoneale omgeving met de cellulaire en mechanische componenten, waar eierstokkanker metastase optreedt.
Abstract
Eierstokkanker wordt gekenmerkt door uitgebreide peritoneale metastase, met tumor bollen vaak gevonden in de kwaadaardige ascites. Dit wordt geassocieerd met een slechte klinische resultaten en mist momenteel effectieve behandeling. Zowel de driedimensionale (3D) omgeving en de dynamische mechanische krachten zijn zeer belangrijke factoren in dat metastatische cascade. Echter, traditionele celculturen niet aan deze natuurlijke tumor micro recapituleren. Dus, in vivo-achtige modellen die de intraperitoneale omgeving kan emuleren zijn evident belang. In deze studie werd een nieuwe microfluidic platform van het peritoneum werd opgezet om de situatie van eierstokkanker sferoïden na te bootsen in de peritoneale holte tijdens metastase. Eierstokkanker sferoïden die onder een niet-hechtende toestand werden gekweekt in microfluïdische kanalen bekleed met peritoneale mesotheelcellen onderworpen aan fysiologisch relevante shear stress. Kortom, deze dynamische 3D eierstokkanker-mesothelium microfluidic platform kan nieuwe inzichten verschaffen over fundamentele biologie van kanker en dienen als een platform voor potentiële screening en de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Introduction
Eierstokkanker is de meest dodelijke gynaecologische kanker en wordt gekenmerkt door wijdverbreide peritoneale verspreiding en de vorming van kwaadaardige ascites 1. Deze uitgebreide peritoneale metastasen is een belangrijke klinische uitdaging en wordt geassocieerd met slechte klinische resultaten. Unlike stevigste carcinomen die metastaseren via het bloed, eierstokkanker verspreidt vooral in de peritoneale holte. Tumorcellen bestaan als multicellulaire aggregaten / sferoïden tijdens het proces van metastase 2. Dat suspensiekweek eierstokkanker stam / tumor-initiërende cellen kunnen verrijken suggereert verder dat deze sferoïden worden geassocieerd met zowel tumor agressiviteit en verbeterde chemoresistance 3, 4. Er zijn verschillen in reactie drug tussen 2D en 3D culturen, die vermoedelijk hebben verschillende moleculaire mechanismen 5.
_content "> De essentiële interactie met de mesothelium construeert de eerste micro-omgeving voor ovariële progressie van de tumor. Deze mesotheelcelsuppletie liggen op een extracellulaire matrix (ECM), waarbij fibronectine is een alomtegenwoordige bestanddeel. Een koppeling tussen de verhoogde expressie van mesotheelcellen cel afkomstige fibronectine en tumorprogressie is aangetoond. fibronectine overvloedig aanwezig is in maligne ascites 6, 7. eierstokkanker cellen kunnen ook de afscheiding van fibronectine van mesotheelcellen induceren teneinde beginnende eierstokkanker metastase 8 promoten.Opkomende bewijs dat mechanische stimuli, waaronder afschuifspanning, celmorfologie, genexpressie kunnen moduleren en dus de fenotypen van tumorcellen 9, 10, 11. Zoals maligne ascites ontwikkelen en accumuleren in tumor progressie, ovarium tumorcellen worden blootgesteld aan fluïdumstroming en de resulterende schuifspanning. Een aantal groepen, ons inbegrepen, hebben de invloed van schuifspanning op eierstokkanker progressie getoond, waaronder cytoskelet modificaties, epitheliale naar mesenchymale transities en kanker stemness 12, 13, 14, 15. Dus een fysiologisch relevante micro belangrijk voor het onderzoek naar tumor peritoneale metastasen. De huidige in vitro hydrodynamische kweeksystemen hebben beperkingen op nabootsen en besturen van een constante, lage, fysiologisch relevante schuifspanning 16, 17, 18, 19. Conventionele in vitro studie gericht op ofwel de cellulaire of mechanische omgeving zijn nog beperkt innabootsen van de complexiteit van de intraperitoneale micro met de juiste fysiologische relevantie.
Hier, om een nieuw model van het peritoneum ingenieur beperkingen van conventionele strategieën overwinnen en de studie van de intraperitoneale compartiment kanker metastase bevorderen, een 3D-microfluïdische platform gecontroleerde fluïdumstroom is gemaakt. In dit model, eierstokkanker sferoïden werden samen gekweekt met primaire humane peritoneale mesotheelcellen in microfluïdische chips onder continue vloeibare stroom (Figuur 1A). De mesotheliale cellen werden uitgeplaat op fibronectine. Niet-hechtende eierstokkanker sferoïden werden uitgezaaid in microkanalen met continue stroom medium geperfundeerd door een spuitpomp. Zowel de 3D-omgeving en de dynamische mechanische krachten zijn zeer belangrijke factoren van de metastatische cascade. Dit platform kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de intraperitoneale micro qua complexe CELlaire en co-cultuur interacties, alsook met betrekking tot dynamisch mechanische signalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze test heeft een flexibele en fysiologisch relevante model met verschillende biochemische en op cellen gebaseerde assays, zoals kan worden opgenomen, maar niet beperkt tot, adhesie testen mesotheelcellen klaring assays en drug discovery. Het kan worden toegepast op de evaluatie van het effect van intraperitoneale micromilieu op progressie van kanker. Echter nodig verschillende proefomstandigheden worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de doelen van het project (bijvoorbeeld het aantal HPMCs en kanker sfero?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Hong Kong Research Grant Raad (subsidies 17.122.014, C1013-15G, 719813E, en 17.304.514). AST Wong is een ontvanger van de Croucher Senior Research Fellowship.
Materials
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin -0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
Referências
- Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling. Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
- Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2. Neoplasia. 12, 128-144 (2010).
- Ksiazek, K., et al. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis. Thromb Res. 35, 53-64 (1984).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307, 58-62 (2005).
- Chang, S. F., et al. Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).
- Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).
- Rizvi, I., et al. Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).
- Ip, C. K., et al. Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress. Sci. Rep. 6, 26788 (2016).
- Avraham-Chakim, L., et al. Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading. PloS one. 8, e60965 (2013).
- Burkhalter, R. J., et al. Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer. Faseb Journal. 26, (2012).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro. Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).
- Ismadi, M. Z., et al. Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application. PloS one. 9, e106493 (2014).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PloS one. 9. 9, e89966 (2014).
