Modélisation Comportement cancer de l'ovaire multicellulaire Spheroid dans un Microdevice Dynamic 3D péritonéale
Summary
Pour étudier la progression de la tumeur ovarienne dans un modèle physiologiquement pertinente, sphéroïdes multicellulaires ont été cultivées dans un microdispositif dans l'écoulement de fluide simulé. Ce modèle 3D dynamique émule l'environnement intrapéritonéale avec les composants cellulaires et mécaniques où les métastases du cancer de l'ovaire se produit.
Abstract
Cancer de l'ovaire se caractérise par une vaste métastases péritonéales, avec des sphères tumorales couramment dans les ascites malignes. Ceci est associé à des résultats cliniques pauvres et manque actuellement de traitement efficace. Les deux (3D) environnement tridimensionnel et les forces mécaniques dynamiques sont des facteurs très importants dans cette cascade métastatique. Cependant, les cultures cellulaires traditionnelles ne parviennent pas à récapituler ce microenvironnement tumoral naturel. Ainsi, in vivo -comme modèles qui peuvent imiter l'environnement intrapéritonéale sont d' une importance évidente. Dans cette étude, une nouvelle plate-forme microfluidique du péritoine a été mis en place pour imiter la situation des sphéroïdes de cancer de l'ovaire dans la cavité péritonéale pendant la métastase. sphéroïdes cancer de l'ovaire générées dans une condition de non-adhérentes ont été cultivées dans des canaux microfluidiques revêtues de cellules mésothéliales peritoneales soumis à une contrainte de cisaillement physiologiquement pertinent. En résumé, ce cancer de l'ovaire-mésothélium micro dynamique 3Dplateforme rofluidic peut fournir de nouvelles connaissances sur la biologie fondamentale sur le cancer et de servir de plate-forme pour le criblage de médicaments potentiels et le développement.
Introduction
Cancer de l' ovaire est le cancer gynécologique le plus mortel et se caractérise par la diffusion péritonéale généralisée et la formation de l' ascite maligne 1. Cette vaste métastases péritonéales représente un défi clinique majeur et est associée à des résultats cliniques pauvres. Contrairement à la plupart des carcinomes solides qui produisent des métastases par le sang, le cancer des ovaires diffuse principalement à l'intérieur de la cavité péritonéale. Les cellules tumorales existent sous forme d' agrégats multicellulaires / sphéroïdes lors du processus de métastases 2. Le fait que la culture en suspension peut enrichir les cellules ovariennes de tige de cancer / tumeurs initiant suggère en outre que ces sphéroïdes peuvent être associés à la fois avec l' agressivité tumorale et de la chimiorésistance 3, 4 améliorée. Il existe des différences dans la réponse aux médicaments entre 2D et 3D cultures, qui ont probablement des mécanismes moléculaires différents 5.
_content "> L'interaction essentiel avec le mésothélium construit le microenvironnement primaire pour la progression d'une tumeur de l'ovaire. Ces cellules mésothéliales sont situés sur une matrice extracellulaire (ECM), où la fibronectine est un constituant ubiquitaire. Un lien entre l'expression accrue de mésothéliale fibronectine provenant d'une cellule et la progression tumorale a été démontrée. la fibronectine est présente en abondance dans l' ascite maligne 6, 7. les cellules cancéreuses de l' ovaire sont également capables d'induire la sécrétion de fibronectine provenant de cellules mésothéliales afin de favoriser la métastase précoce du cancer de l' ovaire 8.De nouvelles preuves montrent que des stimuli mécaniques, y compris la contrainte de cisaillement, peuvent moduler la morphologie des cellules, l' expression des gènes, et, par conséquent, les phénotypes de cellules tumorales 9, 10, 11. Comme ascite maligne développer et accumuler pendant tumor progression des cellules tumorales de l' ovaire sont exposés à un écoulement de fluide et la contrainte de cisaillement résultant. Un certain nombre de groupes, y compris la nôtre, ont montré l'impact de la contrainte de cisaillement sur la progression du cancer de l' ovaire, y compris les modifications du cytosquelette, épithéliale-mésenchymateuse transitions et stemness du cancer 12, 13, 14, 15. Ainsi, un microenvironnement physiologiquement pertinente est important pour l'étude des tumeurs métastases péritonéales. Cependant, les systèmes de culture actuels in vitro hydrodynamiques ont des limites sur mimant et en contrôlant une constante, faible, contrainte de cisaillement physiologiquement pertinents 16, 17, 18, 19. Conventionnel approches in vitro se concentrant sur soit l'environnement cellulaire ou mécanique sont encore limitées dansmimant la complexité du microenvironnement intraperitoneale avec pertinence physiologique approprié.
Ici, dans le but de concevoir un nouveau modèle du péritoine pour surmonter les limites des stratégies conventionnelles et pour faire avancer l'étude du compartiment intrapéritonéale dans les métastases du cancer, une plate-forme 3D microfluidique à base d'un écoulement de fluide contrôlé a été conçu. Dans ce modèle, les sphéroïdes cancer de l' ovaire ont été co-cultivées avec des cellules mésothéliales humaines primaires péritonéaux dans les puces microfluidiques sous écoulement de fluide continu (figure 1A). Les cellules mésothéliales ont été étalées sur fibronectine. cancer de l'ovaire sphéroïdes non adhérentes ont été ensemencées dans des canaux microfluidiques avec un milieu à écoulement continu perfusé par une pompe à seringue. L'environnement 3D et les forces mécaniques dynamiques sont des facteurs très importants de la cascade métastatique. Cette plate-forme peut être utilisée pour étudier le microenvironnement intrapéritonéale en termes de cel complexeinteractions lulaires et co-culture, ainsi que par rapport à des signaux mécaniques dynamiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet essai constitue un modèle flexible et physiologiquement pertinents qui peuvent être incorporés à divers dosages biochimiques et cellulaires, y compris, mais sans s'y limiter, des tests d'adhérence, des tests de libération mésothéliales et le dépistage de la drogue. Elle peut être appliquée à l'évaluation de l'effet du microenvironnement intrapéritonéale sur la progression du cancer. Cependant, plusieurs conditions expérimentales pourraient avoir besoin d'être optimisé, en foncti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Conseil de subventions de recherche de Hong Kong (subventions 17122014, C1013-15G, 719813E et 17304514). AST Wong est un bénéficiaire de la Croucher Senior Research Fellowship.
Materials
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin -0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
Referências
- Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling. Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
- Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2. Neoplasia. 12, 128-144 (2010).
- Ksiazek, K., et al. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis. Thromb Res. 35, 53-64 (1984).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307, 58-62 (2005).
- Chang, S. F., et al. Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).
- Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).
- Rizvi, I., et al. Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).
- Ip, C. K., et al. Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress. Sci. Rep. 6, 26788 (2016).
- Avraham-Chakim, L., et al. Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading. PloS one. 8, e60965 (2013).
- Burkhalter, R. J., et al. Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer. Faseb Journal. 26, (2012).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro. Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).
- Ismadi, M. Z., et al. Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application. PloS one. 9, e106493 (2014).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PloS one. 9. 9, e89966 (2014).
